Funktionsanalyse von Corynebacterium glutamicum Transposon-Mutanten mittels genomischer und metabolischer Hochdurchsatzmethoden

Reimer, Lorenz Christian

In dieser Arbeit wurden zur funktionellen Untersuchung von Genen in einem Pilotprojekt mehrere hundert Transposonmutanten einer Corynebacterium glutamicum Transposon-Mutantenbank auf genomischer und metabolischer Ebene analysiert. Hierfür wurde eine Hochdurchsatz-Methode zur Bestimmung von Transposon-Insertionsorten im Genom etabliert und 725 Insertionsorte ermittelt. Zur metabolischen Charakterisierung der Mutanten wurde die bereits in der Arbeitsgruppe etablierte Hochdurchsatz-Methode angepasst und die metabolischen Profile von 258 zufällig ausgewählten Mutanten untersucht. Eine paarweise Korrelationsanalyse von Metaboliten über den gesamten Datensatz zeigte die Korrelation vieler eng verwandter Metabolite. Darüber hinaus zeigten die Korrelations­analysen die Verbindung von bisher nicht identifizierten Metaboliten zu Gruppen bekann­ter Metabolite, wodurch weitere Hinweise auf deren Identität gesammelt werden konnten. Basierend auf den Verknüpfungen der Metabolite in der Korrelationsanalyse, wurde ein Screening des Datensatzes nach Mutanten mit Akkumulationen von signifikanten Verände­rungen in eng assoziierten Metaboliten durchgeführt. Die Analyse der daraus resultierenden Mutanten ergab zwei Mutanten mit sehr ähnlichem metabolischen Phänotyp. Für die Mutante P7A10 war die Funktion des betroffenen Gens glnE bereits bekannt. Dagegen war die Funktion des in der Mutante P7E1 betroffenen Gens noch unbekannt. Auf Grund der hohen Ähnlichkeit der metabolischen Profile lässt sich als mögliche Funktion des unbekannten Proteins eine Rolle in der Regulation der Ammoniumfixierung vermuten. Anhand einer bereits veröffentlichte Studie zu den Auswirkungen einer Mutation des Gens glnE auf das Metabolom, konnten die mit der Hochdurchsatz-Methode ermittelten Daten bestätigt werden. Da es sich in der Veröffentlichung um eine Deletionsmutante dieses Gens handelt, konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass die Transposonmutation die Funktion des Gens zuverlässig deaktiviert.

In this work the functional analysis of several hundred mutants of a Corynebacterium glutamicum transposon mutant library was performed on the genomic and the metabolic level. Two high-throughput-methods were applied. At first a method for the determination of transposon insertion points was established and 725 insertion points were located. For the metabolic characterization of the mutants, the established high-throughput-method (of the working group) was adapted and the metabolic profiles of 258 random mutants were analyzed. A pairwise correlation analysis of the metabolites over the whole data set showed the correlation of closely related metabolites. Moreover, the correlation analysis showed the association of so far unidentified metabolites with groups of identified metabolites, which provides further information about the identity of these metabolites. Based on the connections of the metabolites in the correlation analysis, a screening for mutants with accumulations of significant changes in the concentration of closely related metabolites was carried out. An analysis of the resulting mutants revealed two mutants with a high similarity in their metabolic profiles. For the mutant P7A10 the function of the affected gene glnE was known. The function of the affected gene in the mutant P7E1 was unknown. Due to the high similarity of the metabolic profiles of both mutants, the gene product might also be involved in the regulation of the ammonium assimilation. A comparison of published metabolic data for a mutant of the glnE gene confirmed the results obtained by the high-throughput-method. Because the published data refer to a deletion mutant of the glnE gene, the effective disruption of the gene function by the insertion of the transposon could also be confirmed.

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Reimer, Lorenz Christian: Funktionsanalyse von Corynebacterium glutamicum Transposon-Mutanten mittels genomischer und metabolischer Hochdurchsatzmethoden. 2012.

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