Systems Biotechnology of Pseudomonas putida for the enhanced production of Polyhydroxyalkanoates: a rational approach for strain and bioprocess engineering

Poblete Castro, Ignacio Andrés

Die Produktion von Kunststoffen aus Erdöl ist mit erheblichen Umweltproblemen verbunden. Darüber hinaus stellt sich die Frage nach der zukünftigen Verfügbarkeit des nicht erneuerbaren Rohstoffs. Während der letzten 30 Jahre haben sich Polyhydroxyalkanoate (PHA) als nachhaltige Alternative zu Erdöl-basierten Produkten durchgesetzt. Im Gegensatz zu synthetischen Kunststoffen haben diese Biopolymere den Vorzug, dass ihre chemische Zusammensetzung sie biokompatibel und zugänglich für Biodegradation macht. Als Teil des natürlichen Kohlenstoffzyklus ist ihre Verwendung CO2-neutral. Trotz einer enormen Wissensbasis über die Synthese umweltfreundlicher Biopolymere ist die industrielle Produktion von PHA immer noch fünf bis zehnmal teurer als die herkömmlicher Kunststoffe. Die vorliegende Arbeit widmet sich diesem wichtigen Thema mit dem Ziel die Produktionsrate von PHAs durch einen systembiotechnologischen Ansatz in Pseudomonas putida als Zellfabrik zu steigern. Zunächst wurde gezeigt, dass lebende Zellen von P. putida und verwandter Spezies als Biokatalysatoren für die Herstellung verschiedener industriell relevanter Grundstoffe geeignet sind. Während kontinuierlicher Kultivierungen in der kontrollierten Umgebung eines Chemostats wurde der Einfluss verschiedener Nährstoff-Limitierungen auf den Stamm P. putida KT2442 sowie dessen Produktion von PHA untersucht. Unter strikter Stickstoff-Limitierung wurden die höchsten PHA-Konzentrationen erreicht, die bisher in kontinuierlichen Kulturen gemessen wurden. Um einen Einblick in die Biosynthese von PHA unter verschiedenen limitierenden Bedingungen zu erhalten, wurden Transkriptom-, Proteom- und Metabolom-Studien durchgeführt. Gleichzeitige Stickstoff- und Kohlenstoff-Limitierung zeigte dabei im Vergleich zu den einzelnen Limitierungen ein stark unterschiedliches Expressionsprofil. Unter den zellulären Komponenten, die am stärksten durch die Nährstoff-Limitierungen beeinflusst waren fanden sich der Energie-Metabolismus, der Fettsäure-Metabolismus, die Stressantwort sowie Bestandteile des Transportsystems. Mit Hilfe des Systembiologischen Ansatzes war es möglich, die PHA Biosynthese unter beiden Limitierungen zu erhöhen. Unter dieser Bedingung wurde die Kohlenstoffquelle am effizientesten und ökonomischsten genutzt. Um die Produktionskosten für PHA weiter zu minimieren, wurden P. putida KT2440 und in silco abgeleitete Stämme unter Bedingungen kultiviert, die eine PHA-Produktion mit der kostengünstigen Kohlenstoffquelle Glukose begünstigen. Der Stamm mit einer Δgcd-Mutation zeigte eine um 60% erhöhte PHA-Akkumulation im Vergleich zum Wildtyp-Stamm. Dabei zeigte dieser Stamm eine hohe spezifische Wachstumsrate und ein Genexpressionsprofil, das durch die Mutation kaum beeinflusst wurde. Um die PHA-Produktion im Industrie-Maßstab weiterzuentwickeln wurde die P. putida-Stämme mit der Methode der Wahl aus der Industrie kultiviert – dem "Fed-batch Process". Nach der Anwendung eines exponentiellen Fütterungsansatzes, um die Bildung von Biomasse zu optimieren sollte die Bildung von PHA über eine gepulste statt lineare Fütterungsstrategie angeregt werden. Diese stellte sich während der Hochdichte-Zellkultivierung als wesentlich geeigneter für die maximale PHA-Biosynthese heraus. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Resultate die Stärke von in silco basierten Methoden der Integration von "Omics"-Daten und Modellierung für die Optimierung von Stämmen für die Biosynthese von polyhydroxyalkanoaten.

Oil-based plastic production processes have given rise to several environmental problems and energy availability. Over the past 30 years, polyhydroxyalkanoates (PHA) have become one of the main sustainable alternatives to replace petroleum-base commodities. These biopolymers have superior features than synthetic plastics since they are produced from biobased sources and their intrinsic chemical composition make them biodegradable, biocompatible, and part of the carbon cycle of the earth. Although there is a vast knowledge base for synthesizing eco-friendly biopolymers, the industrial production of PHAs is still 5-10 more expensive to obtain than conventional plastics. Therefore, the present research addresses this critical issue by using Pseudomonas putida as a cell factory along with a systems biotechnology approach with the aim of enhancing the production of PHAs. First, it was shown that P. putida and related species are suitable as whole-cell biocatalyzers for the production of several value-added industrial compounds. To highlight differences among various nutrient limitations and their influence on PHA synthesis in P. putida KT2442, chemostat cultures were employed to perform well-controlled nutrient limitations. Strict nitrogen-limiting condition reached the highest PHA productivity in standard continuous cultivation ever reported. To gain insight into the PHA machinery, transcriptome, proteome, and metabolome analyses were employed to investigate the metabolic responses under such limiting conditions. Dual limitation showed different expression patterns in comparison to those observed under strict carbon- or nitrogen-limiting conditions. Energy metabolism, fatty acids metabolism, stress response, and proteins belonging to the transport system were the components of the cell which were highly affected by the imposed nutrient limitation. Driven by the systems biology approach, it was possible to increase the PHA accumulation under dual limitation, which shows to use the carbon source in the most efficient and economic manner among all tested conditions. In order to reduce the production costs for PHA synthesis, P. putida KT2440 and in silico-driven metabolically engineered strains were subjected to PHA-producing conditions using the inexpensive carbon source glucose. Indeed, the created Δgcd mutant strain exhibited 60% increase in PHA accumulation as compared to the parental wild-type strain. The mutant maintained a high specific growth rate and exhibited an almost unaffected gene expression profile. To further develop an industrial-scale PHA production process, the P. putida strains were subjected to the industrial process of choice  the fed-batch cultivation. After the application of an exponential-feeding strategy for biomass synthesis, the PHA accumulation stage should be promoted by applying a pulse-feeding instead of a linear-feeding approach, which appears to be more appropriated for PHA synthesis in P. putida within high cell cultivations. In conclusion, the results described in this thesis have shown the strength of in silico modeling and integration of omics measurements to lead metabolic engineering works towards optimal performance of the cell and reengineering processes for the synthesis of polyhydroxyalkanoates.

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Poblete Castro, Ignacio Andrés: Systems Biotechnology of Pseudomonas putida for the enhanced production of Polyhydroxyalkanoates: a rational approach for strain and bioprocess engineering. 2012.

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