Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Antikörperfragmenten gegen das Venezuelanische und Westliche Pferdeenzephalitis-Virus

Rülker, Torsten

Das Venzuelanische und das Westliche Pferdeenzephalitis-Virus (VEEV, WEEV) gehören zur Gattung der Alphaviren. Einige Subtypen dieser Viren sind humanpathogen und zählen als enzephalizide Viren zu den bioterroristischen Agenzien der Kategorie B. Bisher existieren nur wenige monoklonale Antikörper, die nur im Bereich der Diagnostik Verwendung finden. Die Behandlung bei Infektionen erfolgt nur unterstützend, eine antivirale Therapie steht bisher nicht zur Verfügung. Ziel dieser Arbeit war die Generierung von Antikörpergenbibliotheken aus dem Knochenmark immunisierter Makaken (Macaca fascicularis) und die Isolierung virusspezifischer Antikörper mittels Phagen-Display-Technologie. Es konnten spezifisch bindende scFv-Fragmente aus den Immunbibliotheken isoliert werden, welche in das scFv-Fc Antikörperformat überführt und charakterisiert wurden. Die Antikörper wurden erfolgreich als Fänger- und Detektionsantikörper in ELISA- und immunhistochemischen Experimenten eingesetzt. Der einzige gegen das VEE-Virus isolierte Antikörper, ToR67-3B4, wurde im Folgenden auf neutralisierende Eigenschaften untersucht. Dabei wurde in vitro eine Verhinderung der Infektion für einige Virustypen nachgewiesen. Zusätzlich dazu konnten in vivo Mäuse vor der Infektion mit den VEE-Subtypen TrD, Mena II, Fe37c und BeAn8 geschützt werden, wenn eine Behandlung mit dem scFv-Fc-Antikörper ToR67-3B4 6 Stunden nach Infektion durchgeführt wurde. Damit wurde eine Protektion durch den Antikörper nachgewiesen, welcher die Mäuse somit effektiv vor einer Infektion schützt. In dieser Arbeit wurden erstmals virusspezifische Antikörper aus einer Immunantikörpergenbibliothek nach Selektion auf aktiven Viruspartikeln isoliert. Diese Antikörper könnten zur schnellen Identifikation und Detektion von VEEV und WEEV eingesetzt werden. Für den VEEV-spezifischen Antikörper ToR67-3B4 besteht außerdem die Möglichkeit zum Einsatz in der Therapie, da eine Protektion vor Infektionen in vivo nachgewiesen werden konnte.

Venezuelan and Western Equine Encephalitis virus (VEEV and WEEV) belong to the alphavirus genus. Some subtypes of these viruses are pathogenic to humans and are classified as potential agents of biological warfare and terrorism. Today, there are only few monoclonal antibodies available, which are mainly used in diagnostics. Treatment of infection is only symptomatic and supportive, an antiviral therapy is not available. Aim of this study was the generation of immune antibody gene libraries from the bone marrow of immunised macaques (Macaca fascicularis) and the isolation of virus binding antibodies via phage display technology. By using this technique, specifically binding scFv-fragments were isolated from the immune libraries. The scFv fragments were transformed to scFv-Fc antibody format and their binding properties were characterised. The VEEV and WEEV specific antibodies were successfully used as capture and detector antibodies in ELISAs and were used to identify infected cells in immunohistochemistry studies. The neutralising properties from scFv-Fc antibody ToR67-3B4, the only antibody isolated from the immune library derived from the VEEV immunised macaque, were examined in vitro and in vivo. The antibody was able to prevent infection of cells with several virus subtypes. Additionally it was able to prevent mice from being infected by the VEEV subtypes TrD, Mena II, Fe37c and BeAn8, when administered 6 hours after infection. This indicates that scFv-Fc ToR67-3B4 is able to protect mice effectively from infection. This study describes an isolation of virus specific antibodies from an immune antibody gene library via selection on complete and active virus particles which was never shown before. The antibodies show great potential to be used for fast identification and detection of VEEV and WEEV. Especially the VEEV specific antibody ToR67-3B4 could probably be used in therapy because of its ability to protect mice in in vivo challenge studies.

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Rülker, Torsten: Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Antikörperfragmenten gegen das Venezuelanische und Westliche Pferdeenzephalitis-Virus. 2012.

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