Rekombinante Antikörper für die Point‐of‐care‐Diagnostik von CRP

Fröde, David

Das C-reaktive Protein (CRP) ist einer der wichtigsten Blutserummarker für Entzündungsreaktionen und bakterielle Infektionen. Bisher wird seine Konzentration unter großem Zeit- und Kostenaufwand in medizinischen Laboren mit Hilfe von Immunoassays bestimmt. Vor allem in Entwicklungsländern mit häufig mangelnder Infrastruktur ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Point-of-care-Diagnostik von CRP wünschenswert. In der vorliegenden Arbeit wurde das im Rahmen des SFB 578 etablierte, auf einer Quarzkristallmikrowaage (QCM) basierende Lab-on-a-chip-System zur vollautomatisierten, mikrofluidischen CRP-Detektion weiterentwickelt. Zur Steigerung der Sensitivität und Stabilität wurden bereits vorhandene CRP-spezifische scFv-Fragmente sowohl in verschiedene Antikörperformate überführt als auch in Genbibliotheken mutagenisiert, um deren biochemischen Eigenschaften gezielt zu verändern. So konnten hoch affine und extrem stabile Antikörperfragmente generiert werden, die sich besonders für den Einsatz in der Detektionszelle eines Sensor-Chips eignen. Mit der Phagen-Display-Methode konnten zusätzlich weitere CRP-spezifische Antikörperfragmente isoliert werden, die ausschließlich konformationelle Epitope des nativen CRP-Moleküls erkennen. Diese sind zur Anreicherung des CRPs aus Blutseren in der Anreicherungszelle anwendbar. Die gezielte Immobilisierung der CRP-spezifischen Antikörperfragmente auf Goldoberflächen mittels SNAP-Tag-Fusionsproteinen führt zur Erhöhung der Sensitivität des QCM-Chips. Ferner wurde der QCM-Sensor hinsichtlich Spezifität und Regenerierbarkeit in mehrfachen Messungen mit verschiedenen Antikörperfragmenten weiter charakterisiert. So konnten bereits über 100 repetitive CRP-Messzyklen durchgeführt werden. Auch konnte die Anwendbarkeit des Systems für die Detektion weiterer Antigene wie Lysozym und BSA mittels verschiedener Antikörper-Formate demonstriert werden. Somit wurden alle Voraussetzungen für ein CRP-spezifisches Lab-on-a-chip-System erfüllt.

The acute phase protein C-reactive protein (CRP) is the most important blood marker for inflammation and bacterial infections. Its concentration is currently determined with time consuming and cost intensive immunoassays. Thus, there is a great demand for a simple, quick, reliable and cost-efficient Point-of-care testing (POCT). In this work the further development and evaluation of a micro-fluidic, quartz crystal microbalance (QCM) based lab-on-a-chip system for the measurements of whole blood samples are presented. For improvement of the sensitivity and stability of this special system several strategies were conducted. First off already existing scFv fragments were successfully converted into different antibody formats and mutagenized to derive binders with different biochemical properties. Several stable and high affinity binders were generated. These binders can be used for the detection of CRP molecules under denaturating conditions. Secondly, several new CRP specific antibody fragments which are able to bind to conformational epitopes of native CRP molecules were obtained via phage display. These binders can be used for the enrichment of CRP out of the blood serum in an enrichment matrix upstream the QCM-chip. Furthermore, directed immobilization of SNAP-tag labeled CRP specific antibody fragments onto gold surfaces could be shown for the first time. By this, the system’s sensitivity and specificity could be increased. In addition several different antibody fragments and formats were used for further characterization regarding robustness and regeneration of the QCM-sensor. In repeating measurements a concentration dependant detection of different antigens (CRP, Lysozyme and BSA) was demonstrated. For a CRP specific antibody fragment more than 100 measurement cycles could be shown. Thus, all necessary requirements for a fully-automated, micro-fluidic, QCM based lab-on-a-chip system for the point-of-care diagnostic of CRP were fulfilled

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Fröde, David: Rekombinante Antikörper für die Point‐of‐care‐Diagnostik von CRP. 2012.

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