Gentechnisches Enzymdesign zur Verbesserung der Eigenschaften von Isomaltulose-Synthase aus Protaminobacter rubrum

Baumert, Susann

PalatinoseTM, ein Isomer der Saccharose, wird aufgrund seiner ernährungsphysiologischen Eigenschaften im industriellen Maßstab hergestellt. Palatinose wird durch die enzymatische Konversion aus Saccharose gewonnen. Eine kleine Gruppe von Palatinose-bildenden Bakterien besitzt das Enzym Isomaltulose-Synthase (PalI-Enzym), das für die Isomerisierung von Saccharose zu Palatinose verantwortlich ist. Bei dieser Reaktion entsteht neben Palatinose ein ganzes Spektrum an unerwünschten Nebenprodukten, deren Verhältnis nicht nur von Organismus zu Organismus, sondern auch in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen variiert. Der industrielle Prozess zur Herstellung von Palatinose ist weitestgehend optimiert, dennoch verteuern die Mengen der Nebenprodukte den Herstellungsprozess. Im Zuge des semirationalen Enzymdesigns konnten Zusammenhänge zwischen der Struktur und der Eigenschaft des PalI-Enzyms aus P. rubrum hergestellt werden. Hierbei wurde deutlich, dass vor allem ein Vergleich der PalI-Sequenzen aus eng verwandten Organismen eine Möglichkeit bietet, Positionen im palI-Gen zu finden, an denen sich eine Veränderung auf molekulargenetischer Ebene höchstwahrscheinlich auch auf die Eigenschaft des PalI-Enzyms auswirkt. Mit dem Austausch von 6 Aminosäuren N150H, K155Q, G166D, K171R, A173G und E175D gelang es, dem rekombinanten PalI-Enzym aus P. rubrum eine Thermostabilität bei 50 °C von mehreren Stunden zu verleihen. Diese neu gewonnene Enzym-Thermostabilität ist gleichzeitig mit einer drastischen Reduktion der spezifischen Aktivität des mutierten PalI-Enzyms verbunden. Die Substitution der einzelnen Aminosäure Arginin gegen Prolin an der Position 310 in dem rekombinanten PalI-Enzym aus P. rubrum führte zu einer Veränderung des Produktspektrums, ohne die maximale Palatinose-Menge zu verändern. Gleichzeitig ging mit dieser Punktmutation die Thermostabilität verloren.

PalatinoseTM, an isomer of the sucrose, is produced due to its nutritional qualities in the industrial scale. Palatinose is produced by the enzymatic conversion of sucrose. A small group of Palatinose forming bacteria has the enzyme Isomaltulose synthase (PalI enzyme) which is responsible for the isomerization of sucrose to Palatinose. At this reaction a whole spectrum arises next to Palatinose at unwanted by-products whose relationship doesn't vary only from organism to organism but also in dependence of the reaction conditions. The industrial process for Palatinose's production is optimized most largely, the amounts of the by-products nevertheless make more expensive the production process. In the course of the semi-rational enzyme design connections between the structure and the quality of the PalI enzyme could be established from P. rubrum. The comparison of the PalI sequences from closely related organisms provides a way to find positions in the palI gene, where a change affects at the morphological level will most likely also the property of the PalI enzyme. With the exchange of 6 amino acids N150H, K155Q, G166D, K171R, A173G and E175D it turned out well to award a thermal stability of several hours at 50 °C to the recombinant PalI enzyme from P. rubrum. This enzyme thermal stability won newly is connected to a drastic diminution of the specific activity of the mutated PalI enzyme at the same time. The substitution of the single amino acid arginine against proline at the position 310 in the recombinant PalI enzyme from P. rubrum led to a change of the product line without changing the maximum amount of Palatinose. The thermal stability was lost with this point mutation at the same time.

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Baumert, Susann: Gentechnisches Enzymdesign zur Verbesserung der Eigenschaften von Isomaltulose-Synthase aus Protaminobacter rubrum. 2012.

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