Humane Antikörper und ImmunRNasen zur Behandlung von CD30+ Lymphomen

Wezler, Xenia Karola

Die Wirkung tumorspezifischer Antikörper gegen maligne Lymphome kann durch die Fusion mit RNasen verstärkt werden. Nach der spezifischen Bindung solcher ImmunRNasen an ein internalisierendes Antigen wie CD30 auf Tumorzellen, können die RNasen intrazellulär zytotoxisch wirken. CD30 ist auf vielen Lymphomzellen überexprimiert, während es nur auf wenigen gesunden menschlichen Zellen vorkommt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung humaner Antikörper und ImmunRNasen zur Behandlung von CD30+ Lymphomen und der Vergleich der acht enzymatisch aktiven RNasen 1-8 der humanen RNasen A Superfamilie als Effektordomänen. Zunächst erfolgte die Analyse der RNasen 1-8. Da die Produktion der freien RNasen nur mit geringen Ausbeuten möglich war, wurden Fusionsproteine aus dem humanen IgG1-Fc-Teil und den RNasen in Säugerzellen produziert. Dies war für alle RNasen erfolgreich, aber nur die RNasen 1, 4, 5 und 7 ließen sich anschließend durch Spaltung mit einer sequenz-spezifischen Protease separieren. Diese RNasen wurden hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität und deren Inhibition durch den humanen RNase-Inhibitor (RI) analysiert. Für die spezifische Tumorbindung wurden vier neue, aus einer humanen naiven Antikörper-genbibliothek isolierte CD30-spezifische Antikörper als scFv-Fragmente sowie scFv-Fc Antikörper produziert. Der Antikörper SH313-B5 wies eine hohe Affinität für CD30 und die stärkste spezifische Bindung an CD30 auf. Er wurde daher als neue Zellbindedomäne für die ImmunRNasen ausgewählt. Die humanen RNasen 1-8 wurden mit dem scFv-Fc Antikörper SH313-B5 über verschiedene Peptidlinker fusioniert. Neben einem flexiblen Linker wurden intrazellulär spaltbare Adapter untersucht, die eine verbesserte Translokation in das Zytoplasma und eine Freisetzung der RNase vom Antikörper ermöglichen sollten. Die ImmunRNasen wurden in Säugerzellen produziert und wiesen die erwarteten ribonukleolytischen Aktivitäten auf, deren Hemmung durch den RI variierte. Sie banden spezifisch an CD30+ Lymphomzellen und wurden in die Zellen aufgenommen. Der Antikörper SH313-B5-hFc bewirkte allein bereits eine starke Proliferationsinhibition der CD30+ Lymphomzellen, die durch die Fusion bestimmter RNasen verstärkt wurde. Der Einsatz der RNase3 bewirkte den stärksten Effekt mit einem IC50-Wert von 1 nM.

The effect of tumorspecific antibodies against malignant lymphomas can be approved by fusion with RNases. After specific binding of such ImmunoRNases to an internalizing antigen like CD30 on the tumor cell, the RNases can act as cytotoxin in the cytoplasm. CD30 is overexpressed on many lymphomas, while it is rarely present on healthy human cells. The aim of this work was the examination of human antibodies and ImmunoRNases for the treatment of CD30+ lymphomas and the comparison of the eight RNases 1-8 from the human RNase A Superfamily as effector domains. At first the human RNases 1-8 were analyzed. The production of the free RNases was only possible with low yields. Therefore fusion proteins with the human IgG1-Fc-part and the RNases were produced in mammalian cells. All RNases were successfully produced as Fc- fusion protein, but only RNases 1, 4, 5 and 7 could be separated by cleavage with a site-specific protease. These RNases were analyzed regarding their enzymatic activity and their inhibition by the human RNase inhibitor (RI). For the specific tumor binding four new CD30-specific antibodies from a human naïve antibody gene library were produced as scFv-fragments and as IgG-like scFv-Fc antibodies. The antibody SH313-B5 had a high affinity for CD30 and showed the best specific binding to CD30. Because of this it was chosen as new targeting domain for the ImmunoRNases. The human RNases 1-8 were fused to the scFv-Fc antibody SH313-B5 via different peptide linker including a flexible glycine-serine linker as well as intracellular cleavable adapters. The latter should allow better translocation into cytoplasm and the release of the RNases from the antibody. The ImmunoRNases were produced in mammalian cells successfully. They had the expected ribonucleolytic activity, whose inhibition by the RI differed. They bound specifically to CD30+ lymphoma cells und their internalization in the cells were proven. The antibody SH313-B5-hFc alone already caused strong inhibition of proliferation of CD30+ lymphoma cells, which was increased by the fusion with certain RNases. The use of RNase3 showed the strongest effect with an IC50 value of 1 nM.

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Wezler, Xenia Karola: Humane Antikörper und ImmunRNasen zur Behandlung von CD30+ Lymphomen. 2012.

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