Reprogrammierung des Virusresistenzgens N aus Tabak

Niemeyer, Julia

Ein bekanntes Avr/R-System ist das TMV/N-Gen-System aus Tabak. Das N-Gen vermittelt bei Erkennung der TMV-Helikase (p50) Resistenz gegen TMV. Im Rahmen dieser Arbeit sollte mit Hilfe von Pathogen-induzierbaren Promotoren, die die Expression des TMV-p50-Fragmentes regulieren, eine Reprogrammierung des Virusresistenzgens N erfolgen, so dass eine Resistenz gegen bakterielle und pilzliche Pathogene vorliegt. Dafür wurde p50 aus TMV kloniert und mit neun synthetischen Promotoren gekoppelt. In zwei Agrobacterium-basierenden transienten Expressionssystemen wurde zunächst gezeigt, dass die synthetischen Promotoren unter den getesteten Bedingungen aktiv sind. Alle Promotor::p50-Konstrukte wurden in Tabak(nn) transformiert. Transgene Linien wurden mit einer NN-Linie gekreuzt. Die nN-Nachkommen, die die Promotor::p50-Konstukte enthalten, wurden weiter analysiert. Diese Pflanzen zeigten unter sterilen Bedingungen keinen auffälligen Phänotyp. Nach Transfer in Erde zeigten die meisten Pflanzen Nekrosen oder Zwergwuchs. Trotzdem waren bei vielen Linien weiterführende Experimente möglich. Infektion der Pflanzen mit einem nicht-onkogenen Agrobacterium-Stamm führte oftmals zu einer HR. nN-Nachkommen zweier ausgewählter Linien (2S2D::p50, 4D::p50) wurden in Bezug auf eine erhöhte Pathogenresistenz weiter analysiert. Dazu wurden die Pflanzen mit einem onkogenen Agrobacterium tumefaciens-Stamm, mit Pseudomonas syringae pv. tabaci sowie mit Botrytis cinerea infiziert. Es wurde der Krankheitsverlauf, die Genexpression verschiedener PR- und HR-Gene und die Pathogenausbreitung verfolgt. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Reprogrammierung des N-Gens. Wenn p50 konstitutiv exprimiert wurde, kam es wider Erwarten im Samen nicht zu einer HR und die Pflanzen konnten keimen. Erst einige Tage nach Aussaat bildete sich eine HR aus und führte zum Absterben der Keimlinge. Das ist darauf zurückzuführen, dass das N-Gen in Samen nicht exprimiert wird.

A well-known Avr/R system is the TMV/N gene system from tobacco. Here, the N gene mediates resistance to TMV by recognition of the TMV helicase (p50). In the context of this work the reprogramming of the virus disease resistance gene N should be achieved by using pathogen inducible promoters to drive the expression of p50. The goal was to obtain resistance against bacterial and fungal pathogens. For that, nine synthetic promoters were cloned in front of the functional p50 fragment. First, it was found that the synthetic promoters are active in two transient expression systems based on Agrobacterium tumefaciens. All nine promoter::p50-constructs were transformed into tobacco (nn). Transgenic lines were crossed with a NN line. The nN-offspring which contain the promoter::p50-constructs were further analyzed. These plants did not show a remarkable phenotype under sterile conditions. After transfer to soil the offspring of most crosses showed necroses or dwarfed growth. Nevertheless, further experiments were possible with many lines. Infection of these plants with a non-oncogenic Agrobacterium strain often led to an HR. The nN-offspring of two selected lines (2S2D::p50, 4D::p50) were further analyzed regarding an increased disease resistance. Therefore, the plants were infected with an oncogenic Agrobacterium tumefaciens strain, with Pseudomonas syringae pv. tabaci, and with Botrytis cinerea. The course of disease as well as the expression of several PR- and HR-genes and the pathogen spread after infection was analyzed. The results show the successful reprogramming of the TMV disease resistance gene N. When p50 was expressed constitutively there was no HR in the seeds and the plants could germinate. A few days after germination an HR developed and led to dying of the seedlings. This observation can be explained with non-expression of the N gene in seeds. N gene transcript was only detectable a few days after sowing.

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Niemeyer, Julia: Reprogrammierung des Virusresistenzgens N aus Tabak. 2012.

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