Identifizierung von Substanzen zur Verminderung der Pathogenität von Vibrio cholerae durch neuentwickelte Hochdurchsatz-Screeningverfahren

Sergeev, Galina

Vibrio cholerae ist ein Gram-negativer humanpathogener Erreger, der die Durchfallerkrankung Cholera verursacht. Bei Cholera handelt es sich um eine akute intestinale Infektion, die zu starken plötzlich auftretenden Durchfällen, und somit innerhalb kürzester Zeit zu einem hohen Wasser- und Elektrolytverlust führt. Die Übertragung von V. cholerae erfolgt hauptsächlich über die Zufuhr von kontaminiertem Wasser, seltener über die Aufnahme von kontaminierter Nahrung wie Fisch und Meeresfrüchte. Besonders Entwicklungsländer ohne adäquate Trinkwasseraufarbeitung oder Trennung von Abwässern und Frischwasser leiden unter Cholera-Epidemien. Aufgrund der steigenden Resistenzentwicklung gegen die bisher eingesetzten Antibiotika zur Behandlung von V. cholerae Infektionen, besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuer spezifischer Therapeutika. Für die Suche nach neuen Wirkstoffen wurden im Rahmen dieser Arbeit vier unterschiedliche Mikrotiterplatten-basierte Hochdurchsatz-Screening¬verfahren entwickelt und etabliert. Es handelt sich dabei um Verfahren zur Bestimmung von 1. der Wachstumsrate, 2. der Choleratoxin-Expression, 3. der Protoporphyrinogen IX Oxidase-Aktivität und 4. der bakteriellen Adhäsion an Epithel¬zellen. Die Verfahren 1-3 wurden für ein Screening nach aktiven Substanzen genutzt. Im Rahmen eines umfangreichen Screening wurden drei neuen Substanzen mit antibakteriellen Eigenschaften spezifisch gegen V. cholerae identifiziert. Anschließend erfolgten erste experimentelle Untersuchungen zur Targetidentifizierung der aktivsten Substanz vz0825, mit Hilfe einer Gesamtgenom-Sequenzierung des Genom-Pools aus 15 gegen diese Substanz resistenten Mutanten. Im Choleratoxin-Screening wurden sechs neue Substanzen identifiziert, die die Expression der Pathogenitätsfaktoren Choleratoxin und Toxin coregulated Pili inhibieren. Durch Anwendungen von Real Time-PCR-Analysen und Microarray-Analysen erfolgten die ersten experimentellen Untersuchungen zur Targetidentifizierung.

Vibrio cholerae is a pathogenic Gram-negative bacterium that causes the diarrheal disease cholera. Cholera is an acute intestinal infection that leads to severe diarrhea and in short time to extended loss of water and electrolytes. The transmission of V. cholerae occurs mainly through contaminated water, and more rarely through intake of contaminated fish and seafood. Especially developing countries without adequate drinking water treatment and separation of sewage and fresh water suffer from cholera epidemics. Due to the increasing development of resistances against currently used antibiotics for treatment of V. cholera infections, there is an urgent need for the development of new specific therapeutics. To search for new drugs four different microtiter plate based high throughput screening assays were developed and established in this study. These assays were used to determine 1. growth rate of the bacteria, 2. cholera toxin expression, 3. activity of protoporphyrinogen IX oxidase and 4. bacterial adhesion to epithelial cells. Three new compounds with antibacterial activity specifically against V. cholerae have been identified in an extensive screening. The next steps were experimental studies of target identification for the most active compound vz0825 by developing a genome-sequencing of a genome pool out of 15 mutants resistant against this compound. In the cholera toxin screening six new compounds have been identified, which inhibit the expression of virulence factors cholera toxin and toxin coregulated pili. The first experiments for target identification in this case were real time PCR analysis and microarray analysis.

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Sergeev, Galina: Identifizierung von Substanzen zur Verminderung der Pathogenität von Vibrio cholerae durch neuentwickelte Hochdurchsatz-Screeningverfahren. 2012.

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