Environmental Chemical Analysis Related to Drug Industries: Method Development for the Analysis of Benzimidazole Anthelmintics and Corresponding Metabolites in Liquid Pig Manure and Manured Soil

EL-Dosoky, Mohammed Mohammed Ahmed

Durch Behandlung von Nutztieren mit Benzimidazol-Entwurmungsmitteln gelangen diese Substanzen über das Aufbringen von Gülle in Ackerböden. Es sind leistungsfähige Analysenmethoden nötig um die Rückstände der Mittel zuverlässig zu bestimmen. In dieser Arbeit wurde eine analytische Methode entwickelt, die auf der Flüssigkeitschromatographie kombiniert mit Tandemmassenspektrometrie (LC/MS/MS) basiert und die Simultanbestimmung von Fenbendazol, Flubendazol und 8 Metaboliten in Oberflächenwasser, Schweinegülle und gedüngten Böden gestattet. Die Quantifizierung wurde unter Verwendung der LC/MS/MS mittels Elektrospray-Ionisierung (ESI+) durchgeführt. Die Zielkomponenten wurden aus Oberflächenwasser mittels Festphasenextraktion (SPE) bei pH 2.3 mit einer Wiederfindungsrate von > 84 % extrahiert. Bei Gülleproben wurde die direkte Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat bei pH 9.5 oder die Gefriertrocknung gefolgt von einer Extraktion mit MeOH bei unverändertem pH-Wert sowie die Ultraschallextraktion (USE) gefriergetrockneter Gülleproben mit einer Mischung MeOH/Ethylacetat (1: 4, v/v) bei pH 9.5 eingesetzt. Die Rohextrakte wurden mit der Größenausschlußchromatographie (SEC) gefolgt von der Festphasenextraktion (SPE) gereinigt. Bei den Gülleproben lag die Wiederfindungsrate im Bereich von 78 bis 118 % mit relativen Standardabweichungen von ≤ 19 %. Böden bzw. güllegedüngte Böden wurden über die direkte Flüssigextraktion oder mittels Ultraschalltechnik unter Einsatz verschiedener Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemische extrahiert. Im alkalischen pH-Bereich wurden mit einem MeOH/Ethylacetat-Gemisch (1:4, v/v) alle Komponenten bei einer Wiederfindungsrate von 70 bis 119 % und einer relativen Standardabweichung von ≤ 21 % aus den Böden extrahiert. Die Bestimmungsgrenzen reichten von 0.5 bis 1 bzw. 1.6 bis 3.1 µg/kg für frische Gülle. Bei Böden bzw. bei güllegedüngten Böden wurden 0.7 bis 2.5 µg/kg und 2.4 bis 7.9 µg/kg erreicht. Dotierte und anschließend bei 4 °C und 20 °C für 30 Tage inkubierte Gülleproben wurden analysiert um Alterungseffekte auf die Extrahierbarkeit der Zielkomponenten zu überprüfen. Matrixeffekte, welche durch die Coeluation von Matrixbestandteilen der Proben entstanden, wurden durch Verwendung verschiedener Kalibrierungsansätze untersucht. Mittels einer Standardadditionsmethode konnten die Effekte effizient kompensiert werden. Schließlich wurden Flubendazol und 3 Metabolite in 7 realen Gülleproben bestimmt und die Ergebnisse gemäss den Richtlinien der analytischen Qualitätssicherung (European Commission Decision 2002/657/EC) bestätigt.

Benzimidazole anthelmintics enter agricultural land by using manure of treated animals as soil amendment. Efficient analytical methods are required to identify and reliably quantify the residues of these compounds. In this study an analytical method based on liquid chromatographic coupled to tandem mass spectrometry was developed for the simultaneous determination of fenbendazole, flubendazole and 8 of their corresponding metabolites in surface water, liquid pig manure, soil and manured soil. The quantification was conducted using electrospray ionization (ESI) in positive mode. Target compounds were extracted from surface water using solid phase extraction (SPE) at pH 2.3 with recovery rates  84%. For target compound extraction from manure samples, direct solvent extraction using ethyl acetate at pH 9.5 or lyophilization followed by methanol extraction at original pH as well as ultrasound-assisted solvent extraction (USE) of lyophilized manure samples using a methanol/ethyl acetate mixture (1:4, v/v) at pH 9.5, were successfully used. Size exclusion chromatography (SEC) followed by SPE were used to clean-up the raw extracts. For manure samples, the overall recovery rates ranged from 78 to 118 % with relative standard deviations of ≤ 19 %. Soil and manured soil samples were treated via direct solvent extraction or USE technique using different solvents and solvent mixtures. At alkaline pH using methanol/ethyl acetate mixture (1:4, v/v), all compounds were efficiently extracted from soil and manured soil with overall recovery rates ranged from 70 to 119 % and relative standard deviations were ≤ 21 %. The method detection and quantitation limits ranged from 0.5 to 1 and from 1.6 to 3.1 µg/kg fresh manure. They were between 0.7 to 2.5 µg/kg and 2.4 to 7.9 µg/kg for soil and manured soil samples, respectively. Incubated spiked manure samples for 30 days at 4 and 20 ºC, were analyzed in order to check the aging effect on the extractability of the target compounds. Matrix effects were investigated using different calibration approaches. Standard addition method was efficient to compensate these effects. Therefore, it was used to quantify the concentrations of detected compounds in the real samples. Flubendazole and 3 of its metabolites were detected in 7 real manure samples. Confirmation of positive finding was successfully achieved meeting the current requirements of analytical quality assurance in accordance with European Commission Decision 2002/657/EC.

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EL-Dosoky, Mohammed Mohammed Ahmed: Environmental Chemical Analysis Related to Drug Industries: Method Development for the Analysis of Benzimidazole Anthelmintics and Corresponding Metabolites in Liquid Pig Manure and Manured Soil. 2012.

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