Untersuchung zur Stabilität exprimierender S/MAR-Minicircles für die industrielle Anwendung in Zelllinien

Heine, Markus Andree

Es gibt unterschiedliche Verfahren zur Manipulation und Modifikation von Zellen zur Expression von rekombinanten therapeutischen Proteinen. Es wird dabei zwischen integrierenden und nicht-integrierenden, episomal vorliegenden Vektoren unterschieden. Der episomal replizierende Vektor pEPI besitzt eine „scaffold matrix attachment region“ (S/MAR, SAR E), die durch Wechselwirkungen mit Proteinen der Kernmatrix eine Bindung an diese vermittelt und für die stabile Replikation und Segregation des Vektors während der Zellteilung verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurde die Verwendung eines, auf dem Vektor pEPI basierenden, Minicircles (pEPI-delCM18-Minicircle) zur stabilen Transgenexpression untersucht. Durch die besonderen Eigenschaften dieses Minicircles sollte eine stabile episomale Etablierung des Minicircles im Zellkern ohne Selektionsdruck möglich sein. Es wurde ein stabiles Zwei-Minicircle-Expressionssystem zur Generierung von rekombinanten Antikörpern in CHO-K1-Zellen entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass es überwiegend zu einer episomalen Etablierung der zirkulären Minicircles kommt. Der Minicircle-Transfer führt gerade in CHO-K1-Zellen häufig zu ungerichteten Minicircle-Integrationen in das CHO-Genom und Deletionen innerhalb des Minicircles durch Doppelstrangbrüche. Aufgrund dessen wurde ein Konzept zur Inhibierung der Integration des Minicircles in das Wirtsgenom entwickelt. Darüber hinaus wurde die episomale Etablierung des Minicircles in einer neuen, von humanen Amniozyten abgeleiteten, Zelllinie (CAP) nachgewiesen. Durch Sequenzvergleich des SAR M18 mit dem CHO-K1-Genom konnte gezeigt werden, dass die Gefahr einer Integration über das SAR M18 durch homologe Rekombination gering ist. Es wurde weiterhin ein neues Verfahren zur Generierung von hochreiner Minicircle-DNA entwickelt. Dieses erfordert keine zusätzlichen, z.B. zur Generierung oder Aufreinigung von Minicircle-DNA benötigten, Sequenzen im Ursprungsvektor bzw. Minicircle.

A great number of methods for the expression of therapeutic proteins with mammalian cells are well-established. The used DNA-vectors are divided into integrating and non-integrating, episomal vectors. Episomal vectors don´t influence the genomic gene-regulation and –function, therefore, until now, no insertional mutagenesis or cell transformations have been observed. The episomal replicating vector pEPI contains a ‘scaffold matrix attachment region’ (S/MAR, SAR E). This specific region interacts with nuclear matrix proteins and enables the stable episomal vector-replication during the cell cycle. In this thesis, the transgene expression with the pEPI-derived minicircle ‘pEPI-delCM18’ was analysed. This minicircle contains a size-reduced SAR E, the SAR M18, and is lacking in prokaryotic vector parts, e.g. a resistance marker. Therefore, a stable episomal vector-establishment should be possible in the absence of selection pressure. Based on the minicircle pEPI-delCM18, a stable two-minicircle-expression-system in CHO-K1 cells was developed. Thereby minicircles could be detected in the episomal status predominantly. However, additional genomic minicircle-integration events were often detected in CHO-K1 cells. Thus a concept to reduce random integrations was developed. Moreover the stable episomal minicircle-establishment was shown in a new commercially available human cell line (CAP), which is derived from human amniocytes. A sequence alignment of the SAR M18 with two CHO-K1 genomes showed that the minicircle-integration is not mediated by sequence homologies between SAR M18 and CHO-K1 gDNA. Furthermore, a new powerful method for producing high-purity minicircles without any recombination or recognition sites was developed. For this reason, this method offers a fast and easy production of minicircles.

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Heine, Markus Andree: Untersuchung zur Stabilität exprimierender S/MAR-Minicircles für die industrielle Anwendung in Zelllinien. 2012.

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