Der molekulare Adapter BEM-1 in Zellpolaritèt, gerichtetem Wachstum und Zell-Fusion in Neurospora crassa

Schürg, Timo

In der vorliegenden Arbeit wurde der filamentöse Pilz Neurospora crassa als Modell zur Untersuchung eukaryotischer Zell-Fusion verwendet. Keimende vegetative Sporen von N. crassa wachsen gerichtet aufeinander zu und fusionieren. Hierbei kommunizieren sie vermutlich über sekretierte Signalmoleküle. Die Proteine MAK-2 und SO werden während der Phase des gerichteten Wachstums entgegengesetzt oszillierend aus dem Zytosol an die Plasmamembran der Keimschlauchspitzen rekrutiert. Diese Beobachtung deutet auf einen Kommunikations-Mechanismus hin, welcher vermutlich auf wechselseitigem Senden und Empfangen beruht. Das Homolog der MAP Kinase MAK-2 in Saccharomyces cerevisiae Fus3p ist Teil einer MAP Kinase-Signalkaskade, welche nach Bindung des Paarungs-Pheromons an seinen Rezeptor aktiviert wird. Das Signalprotein Bem1p sorgt bei diesem Prozess für eine molekulare Verbindung zwischen dem MAP-Kinase-Modul, den stromaufwärts befindlichen Komponenten der Signalkaskade und der Zellpolaritätsmaschinerie. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das entsprechende N. crassa Homolog BEM-1 identifziert. Eine delta bem-1 Mutante zeigte starke Defekte in der vegetativen Keimlings- und Hyphenfusion. Ein BEM-1-GFP Fusionsprotein wurde an der Spitze von wachsenden Hyphen und Keimlingen sowie an den Septen detektiert. Während der gerichteten Interaktion fusionierender Keimlinge konzentrierte sich BEM-1-GFP am Fusionspunkt. Die gerichteten Interaktionen der delta bem-1 Keimlinge waren nicht nur reduziert, sondern auch zeitlich verzögert. Die in gleicher Weise zeitlich verzögerte Aktivierung der MAP Kinase MAK-2 könnte darauf hindeuten, dass BEM-1 die effiziente Aktivierung von MAK-2 unterstützt. Die Ergebnisse der Untersuchung zur subzellulären Lokalisation von MAK-2-GFP und SO-GFP Fusionsproteinen in interagierenden delta bem-1 Keimlingen ließ vermuten, dass BEM-1 eine Funktion bei der Stabilisierung der intra- und interzellulären Kommunikation übernimmt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit führten abschließend zu der Hypothese, dass das Signalprotein BEM-1 in N. crassa ein mögliches Bindeglied darstellt, welches die Zellpolaritätsmaschinerie mit MAP Kinase- und ROS-basierter Signaltransduktion koppelt.

In the present work the filamentous fungus Neurospora crassa was employed as a model organism to investigate eukaryotic cell fusion. Germinating vegetative spores of N. crassa attract each other and fuse. To sense and locate each other, the germlings communicate probably via secreted signaling molecules. By adjusting the cellular growth of the germ tubes, cells establish the required physical contact. During directed growth the cytoplasmic proteins MAK-2 and SO are oppositely recruited to the plasma membrane at the germ tube tips in an oscillating manner. This observation suggests a communication mechanism which is based on alternating signal sending and recieving. The homolog of the MAP kinaes MAK-2 in Saccharomyces cerevisiae Fus3p is part of a MAP kinase signaling cascade which gets activated after binding of the mating pheromone to its cognate receptor. Within this process, the signaling protein Bem1p serves via its protein-protein interaction domains as a molecular adaptor between the MAP kinase module, the upstream components of the signaling cascade and the cell polarity machinery. In this work, the respective N. crassa homolog BEM-1 has been identified. A delta bem-1 mutant showed strong defects in vegetative germling and hyphal fusion. A BEM-1-GFP fusion protein was detected at tips of growing hyphae and germlings, as well as at septa. During the tropic interactions of fusion germlings, BEM-1-GFP concentrated at the fusion point. Tropic interactions of the delta bem-1 germlings were not only reduced but also occurred delayed. With the same temporal delay, the MAP kinase MAK-2 was activated in the delta bem-1 mutant. This correlation might suggest that BEM-1 promotes efficient MAK-2 activation. The analyses of MAK-2-GFP and SO-GFP fusion proteins in tropically interacting delta bem-1 germlings suggested a function of BEM-1 in stabilizing the intra- and intercellular communication. Analyses of mutants, in which individual protein domains present in BEM-1 were deleted, revealed that the PB-1 domain has strong impact on tropic germling interactions and on spore size definition. In conclusion the results of this work suggest that the signaling protein BEM-1 is a potential molecular adaptor which couples cell polarity with MAP kinase- and ROS-based signal transduction in N. crassa.

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Schürg, Timo: Der molekulare Adapter BEM-1 in Zellpolaritèt, gerichtetem Wachstum und Zell-Fusion in Neurospora crassa. 2012.

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