Incorporation of the prosthetic heme group into cytoplasmic and membrane proteins

Huhn, Simone

Tetrapyrroles are macromolecules involved in nearly all fundamental biologically processes and further represent essential components of many organisms metabolism. They play a central role in electron transfer-dependent, energy-generating processes like photosynthesis and respiration. Heme, an iron containing tetrapyrrole acts as a prosthetic group for e. g. hemoglobin, which mediates oxygen transport in the blood. It was investigated how heme arrives at its functionally destination in cytoplasmic or membrane-bound proteins. The aim of this study was the identification of heme-binding or transporting proteins in vivo by a Pseudomonas aeruginosa "Bacterial Adenylate Cyclase Two-Hybrid System". By means of these screenings a possible heme-transporter was isolated among many hydrophobic so far not characterized proteins. Further studies revealed this protein to be an iron-transporter, potentially responsible for iron transport to ferrochelatase. In a second project the E. coli protein HemW was to be biochemically and biophysically characterized. A Lactococcus lactis hemW mutant was known to accumulate free heme in the cell however not able to respire on supplementation with heme. An E. coli hemW mutant was successfully complemented with the hemW gene of L. lactis. The E. coli protein HemW was isolated under anaerobic conditions and chromatographically purified HemW contains a [4Fe-4S] cluster, like its L. lactis relative. Furthermore HemW dimerizes and binds heme specifically and covalently. During this binding-process an electron transfer from the [Fe-S] cluster to an as of yet to be identified bound heme takes place.

Tetrapyrrole sind Makromoleküle, die an fast allen fundamentalen biologischen Prozessen beteiligt sind und darüber essentielle Komponenten des Stoffwechsels vieler Organismen auf der Erde darstellen. Sie spielen eine zentrale Rolle in elektronentransfer-abhängigen, Energie-generierenden Prozessen wie der Photosynthese und Atmung. Das Fe-haltige Tetrapyrrol Häm repräsentiert u. a. die prosthetische Gruppe von Hämoglobin, das für den Sauerstofftransport im Blut verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurde untersucht wie das Häm an seinen funktionellen Zielort in cytoplasmatische oder membrangebundene Proteine gelangt. Ziel der Arbeit war die Identifikation Häm-bindender oder Häm-transportierender Proteine in vivo mittels des Pseudomonas aeruginosa "Bacterial Adenylate Cyclase Two-Hybrid Systems". Mit Hilfe dieses Screenings konnte neben vielen hydrophoben nicht-bisher charakterisierten Proteinen ein Kandidat isoliert werden, der sich als möglicher Häm-Transporter zeigte. In weiteren Untersuchungen stellte sich dieses Protein als potentieller Eisen-Transporter heraus, der für den Fe-Transport zur Ferrochelatase verantwortlich sein könnte. In einem zweiten Projekt sollte ein Protein, E. coli HemW, biochemisch und biophysikalisch untersucht werden. Von dem Lactobacillus Lactococcus lactis war eine hemW Mutante bekannt, die freies Häm in der Zelle akkumulierte und auch durch Supplementation von Häm nicht respirieren konnte. Es gelang zudem eine E. coli hemW Mutante mit dem L. lactis hemW-Gen zu komplementieren. Das E. coli Protein HemW wurde unter anaeroben Bedingungen isoliert und chromatographisch gereinigt. E. coli HemW verfügt wie der Lactobacillus-Verwandte über ein [4Fe-4S] Cluster. Desweiteren dimerisiert HemW und es verfügt über die Fähigkeit Häm spezifisch und kovalent zu binden. Während dieser Bindung erfolgt eine Elektronenübertragung vom [Fe-S] Cluster auf das gebundene Häm.

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Huhn, Simone: Incorporation of the prosthetic heme group into cytoplasmic and membrane proteins. 2012.

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