Untersuchungen zur Dimerisierung der Stickstoffmonoxid-sensitiven Guanylyl-Cyclase

Krähling, Jan Robert

Die Stickstoffmonoxid-sensitive Guanylyl-Cyclase ist ein wichtiges Ziel für Arzneimittel zur Behandlung von Herzkreislauferkrankungen. Das Enzym besteht aus einer α1- und einer β1 Untereinheit. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten wir eine neue besonders effiziente Anreinigung dieses Heterodimers etablieren. Mit Hilfe dieser neuen Methode konnten wir nachweisen, dass eine humane Spleißvariante der α1 Untereinheit mit der β1 Untereinheit ein katalytisch aktives Heterodimer bildet. Darüber hinaus zeigte sich in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie, dass die aminoterminal um 258 Aminosäuren verkürzte α1-Variante eine spezifische Lokalisation am endoplasmatischen Retikulum aufweist. Dieser Befund deckt sich mit Ergebnissen zur subzellulären Verteilung der Spleißvariante bei Differenzierungsprozessen in embryonalen Stammzellen. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden die Bedingungen der Dimerisierung und Expression der Stickstoffmonoxid-sensitiven Guanylyl-Cyclase näher untersucht. Dabei konnten wir zeigen, dass eine weitergehende aminoterminale Deletion der α1 Untereinheit bei Koexpression mit der β1 Untereinheit zu einem Verlust der Aktivierbarkeit durch NO führt. Die Bindung von Häm und die Dimerisierung blieben hierbei erhalten. Dagegen führte die analoge aminoterminale Deletion der β1 Untereinheit nach Koexpression mit der α1 Untereinheit zu einem hämfreien Enzymkomplex. In zellfreien Expressionsystemen konnten wir die Untereinheiten des Enzyms erfolgreich exprimieren. Es kam allerdings nicht zur Bildung von funktionell aktiven Heterodimeren. Die Ergebnisse deuten auf eine wichtige Rolle von zellulären Bestandteilen für die Bildung eines intakten heterodimeren Enzyms hin.

The nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase is an important target for drugs to treat cardiovascular diseases. The enzyme consists of an α1-and β1 subunit. In the present study we were able to establish a new efficient purification method of this heterodimer. Using this new protocol we were able to demonstrate that a splice variant of human α1 subunit is able to build a catalytically active heterodimer with β1 subunit. Moreover, we could show that this truncated α1-variant has a specific localization at the endoplasmic reticulum. This finding is consistent with results of the subcellular distribution of the splice variant in differentiation processes in embryonic stem cells. In a second part, the terms of the dimerization and expression of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase were examined. We have shown that a more extensive amino-terminal deletion of the α1 subunit leads to a loss of activation by NO. The binding of heme and dimerization were obtained here. In contrast, the analogous amino-terminal deletion of the β1 subunit coexpression led to a heme free enzyme complex. In cell-free expression systems we were able to express the subunits of the enzyme successfully. However, the formation of functionally active heterodimers could not be shown. The results suggest an important role of cellular components for the formation of an intact heterodimeric enzyme.

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Krähling, Jan Robert: Untersuchungen zur Dimerisierung der Stickstoffmonoxid-sensitiven Guanylyl-Cyclase. 2012.

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