Metabolomanalyse von Pseudomonas putida und Entwicklung eines Verfahrens zur Strukturanalyse unbekannter Verbindungen in bakteriellen Zellextrakten

Jäger, Christian

In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen abiotischer Stressfaktoren auf den Metabolismus von Pseudomonas putida mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie untersucht. Ein Vergleich der quantitativen Metabolitzusammensetzung über den Verlauf einer Batch-Kultivierung zeigte spezifische Regulationsphänomene von Metabolitgruppen, die den einzelnen Wachstumsphasen zugeordnet werden konnten. Bei Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen (Glukose, Succinat, Benzoat) ergeben sich substrat-spezifische Metabolitmuster. Die Kultivierung auf Succinat zeigt signifikante Veränderungen von Intermediaten des Stickstoffmetabolismus, während die Kohlenstoffquelle Benzoat erniedrigte Metabolitpools des Zentralstoffwechsels hervorruft. Der Einfluss von Kälte manifestiert sich in der Akkumulation diverser Metabolite, u.a. phosphatierte Saccharidderivate sowie verzweigte Moleküle. Ein qualitativer Vergleich der Metabolitzusammensetzung mit anderen Mikroorganismen weist darauf hin, dass die Metabolite Glutamat, Putrescin und Trehalose aufgrund ihrer Abundanz und Regulation eine zentrale Rolle in der metabolischen Antwort von P. putida auf diverse Stressfaktoren einnehmen. Im zweiten Teil wurde ein Verfahren zur Strukturanalyse von unbekannten Metabolitderivaten mittels GC-APCI-MS/MS entwickelt. Dabei erfolgt im ersten Schritt die Bestimmung der Summenformel über die exakte Masse. Mittels Kultivierung der Bakterien auf isotopen-markierten Substraten (13C, 15N) kann die Anzahl an Kohlenstoff-, bzw. Stickstoffatomen sowie der Derivatisierungsgrad durch die Verwendung von deuterierten Derivatisierungsmitteln (Methoxy-d3-amin, MSTFA-d9) bestimmt werden. Die Festlegung der Elementarzusammensetzung ist über die Kombination dieser Informationen eindeutig möglich. Anhand der Informationen aus MS/MS-Spektren können weitere Vorhersagen möglicher Strukturen gemacht werden. Der Prozess wird anhand von Beispielen aus polaren Bakterienextrakten gezeigt.

In this work the effects of abiotic stress factors on the metabolism of Pseudomonas putida were analyzed using gas chromatography-mass spectrometry. The quantitative metabolite composition of P. putida was defined over time during growth on glucose in a batch-culture. Regulation of specific metabolite patterns could be observed. These metabolites were mainly defined by the individual growth phases. Moreover, the cultivation on different carbon sources (glucose, succinate, benzoate) revealed substrate-specific metabolite patterns. Significant changes regarding intermediates of the nitrogen metabolism occurred during cultivation on succinate. Cells grown on benzoate showed decreased metabolite pools in central metabolism. The cellular response to cold stress is reflected by the accumulation of sugar phosphates and compounds with branched side chains. A comparison of P. putida with other bacteria revealed the closely related regulation of glutamate, trehalose and putrescine to the cellular stress response. Unfortunately, a large number of metabolites in bacterial cell extracts can not be identified by searching commercially and publicly available mass spectral libraries. Therefore, a work flow for the identification of unknown compounds was developed by combining different methods for structure elucidation of novel metabolites. At first, the exact mass of the molecular ion is determined by GC-APCI-MS. By cultivation of bacteria on isotope-labeled substrates (13C, 15N) the number of incorporated carbon or nitrogen atoms can be proposed. Furthermore, the list of possible elemental formulae can be reduced by using deuterated derivatization reagents (methoxy-d3-amine, MSTFA-d9). Additionally, by gathering MS/MS information it is possible to predict plausible structures by chemical databases. The described process is demonstrated by applying it to unknown compounds from polar bacterial extracts.

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Jäger, Christian: Metabolomanalyse von Pseudomonas putida und Entwicklung eines Verfahrens zur Strukturanalyse unbekannter Verbindungen in bakteriellen Zellextrakten. 2011.

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