Entwicklung von Cysteinprotease-Assays zur Validierung von Cysteinprotease-Inhibitoren am Beispiel der SARS-CoV Hauptprotease

Ludewig, Stephanie Kristin

Cysteinproteasen stellen bedeutsame Targets in der Arzneistoffentwicklung dar. Um die Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren an diesen Zielstrukturen zu testen und somit eine geeignete Leitstruktur für die Arzneistoffentwicklung zu finden, gibt es zahlreiche Möglichkeiten biologische Wertbestimmungen (sog. Assays) zu entwickeln. In der vorliegenden Arbeit wurde die Methodik eines kontinuierlichen fluorimetrischen Assays angewandt. Für einen validen Assay ist es wesentlich, die chemischen und physikalischen Eigenschaften der potenziellen Inhibitoren zu betrachten, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Solche falsch positiven Ergebnisse treten zum einen durch den sogenannten inneren Filtereffekt oder auch durch Aggregation der Testsubstanz auf. Um diese Effekte zu detektieren und somit richtig positive von falsch positiven Ergebnissen abgrenzen zu können, wurde ein Arbeitsablauf exemplarisch anhand der Cysteinprotease Cathepsin B und der Serinprotease Chymotrypsin erarbeitet. Dabei wurden einfache Methoden zur Detektion und Korrektur des inneren Filtereffektes und der Detektion und Größenbestimmung von Aggregaten erarbeitet. Ebenso wurde die Detektion unspezifisch kovalenter Inhibitoren eingebunden sowie Messtechniken zur Bestimmung der Art der Inhibition (reversibel, irreversibel) und der Kinetik von Inhibitoren (kompetitiv, nicht-kompetitiv, unkompetitiv). Nach Erarbeitung des Assay-Arbeitsablaufs an den beiden genannten Proteasen, konnte dieser erfolgreich auf das betrachtete Target, die SARS-CoV Hauptprotease, übertragen werden und damit eine Hitvalidierung bereits publizierter Inhibitoren durchgeführt werden. Mit ausgewählten falsch positiven sowie unselektiv kovalent bindenden Testsubstanzen aus der Hitvalidierung der SARS-CoV MPro wurden an möglichst diversen Cysteinproteasen wie Cathepsin B, Clostripain, Calpain-1 und Caspase-1 Selektivitätstestungen durchgeführt.

Cysteine proteases are important targets in drug development. There are many different ways to develop enzymatic assays to test the inhibitory potency of potential inhibitors in the search for new lead structures. Here the methodology of a continuous fluorimetric assay was applied. For the development of a valid assay it is essential to consider the physiochemical properties of the potential inhibitors to avoid false positive results. Those false positive results emerge from the so-called inner filter effect or from aggregation of the compounds. To detect these effects and thus to distinguish true positive from false positive results an assay workflow was developed with cathepsin B as a prototype cysteine protease and chymotrypsin as a prototype of a serin protease. This workflow consists of simple methods for detection and correction of the inner filter effect, for detection and determining the size distribution of aggregates and for detection of unspecific covalent inhibitors. Furthermore, methods to determine whether or not inhibition is reversible were applied in addition to the determination of the exact mechanism of inhibition (competitive, noncompetitive, uncompetitive). After the development of the assay workflow with these two proteases, it could successfully be transferred to the target, the SARS-CoV main protease, to perform a hit validation with previously published inhibitors. Selected compounds yielding false positives results as well as unspecific covalent inhibitors from the hit validation of SARS-CoV MPro were tested at diverse cysteine proteases such as cathepsin B, clostripain, calpain-1 and caspase-1 for selectivity.

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Ludewig, Stephanie Kristin: Entwicklung von Cysteinprotease-Assays zur Validierung von Cysteinprotease-Inhibitoren am Beispiel der SARS-CoV Hauptprotease. 2011.

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