Structural Characterisation of Fungal and Bacterial Amyloids by Hydrogen/Deuterium Exchange NMR Spectroscopy

Zimmer, Agnes

In den letzten Jahren wurde für zahlreiche Amyloide gezeigt, dass diese physiologisch relevante Zellfunktionen übernehmen. Im Gegensatz zu krankheitsassoziierten Amyloiden fibrillisieren diese Proteine ohne toxischen Nebeneffekt in geordnete beta-faltblattreiche Aggregate. Die Bestimmung hochaufgelöster Strukturen von Amyloidfibrillen ist von hohem Interesse, da so deren Bildung und Stabilität besser verstanden werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinant hergestellte Fibrillen der HET-s Priondomäne des Fadenpilzes Fusarium graminearum FgHET-s(218-289) sowie der CsgA Amyloiddomäne aus E. coli EcCsgA(40-151) mittels Wasserstoff/Deuterium Austausch NMR-Spektroskopie untersucht. Die Austauschraten zeigten in beiden Fällen, dass die gebildeten Fibrillen außerordentlich stabil und homogen sind. Zusammen mit Festkörper-NMR Daten belegten die Austauschraten, dass die HET-s Homologen aus Fusarium graminearum und Podospora anserina trotz geringer Sequenzidentität strukturell eng verwandt sind. Beide Priondomänen formen eine sehr ähnliche beta-Solenoidstruktur, die eine speziesübergreifende Priontransmission ermöglicht. Der dreieckige hydrophobe Kern und wichtige Strukturelemente sind evolutiv konserviert. Wasserstoff/Deuterium Austausch- sowie Thiol-Markierungsexperimente zeigten, dass der EcCsgA Amyloidkern strukturell repetitiv aufgebaut ist. Es wurde vorgeschlagen, dass EcCsgA eine beta-Solenoidstruktur bildet. Des Weiteren wurden heteronukleierte Fibrillen untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass in vitro generierte EcCsgB Fibrillen kein geeigneter Nukleationskeim sind. Um lösliche amyloid-ähnliche Faltungsintermediate von EcCsgA zu untersuchen, wurde zudem ein Set von Fusionsproteinen generiert und hinsichtlich Löslichkeit und amyloidogener Faltung untersucht. Es wurden zwei Analoge identifiziert, die löslich hergestellt werden können und teilweise stabil gefaltet sind.

In recent years, an increasing number of proteins has been shown to form amyloids that are involved in a large variety of cellular processes. Contrary to disease-related amyloids, these proteins fibrillise without toxic side effect into well ordered beta-sheet rich structures. In order to understand the formation and stability of these entities, well resolved structural data of amyloid fibrils are necessary. Recombinant fibrils of the HET-s prion domain from the filamentous fungus Fusarium graminearum FgHET-s(218-289) and the CsgA amyloid core of E. coli EcCsgA(40-151) were analysed by hydrogen/deuterium exchange NMR spectroscopy. The exchange rates demonstrated the formation of exceptionally stable and homogenous fibrils. In conjunction with solid state NMR experiments, the obtained exchange data revealed a close structural relationship of the HET-s homologues from Fusarium graminearum and Podospora anserina despite low sequence identity. Both prion domains constitute the same beta-solenoid fold enabling prion transmission between different species. The triangular hydrophobic core and major structural elements were identified to be conserved. Hydrogen/deuterium exchange analysis and thiol-labelling studies revealed a repetitive structural pattern of the amyloid core of EcCsgA with five imperfect repeats forming each a strand-turn-strand motif. Altogether EcCsgA(40-151) was suggested to fold into a beta-solenoid. Furthermore, heteronucleated EcCsgA fibrils were also subjected to hydrogen/deuterium exchange experiments. The corresponding experiments revealed that in vitro formed EcCsgB fibrils are no adequate seed. In order to analyse amyloid-like intermediates of EcCsgA, numerous fusion proteins were generated and analysed in consideration of their solubility and (non)amyloidogenic behaviour. At least two protein constructs were identified to be soluble and folded to a certain extend.

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Zimmer, Agnes: Structural Characterisation of Fungal and Bacterial Amyloids by Hydrogen/Deuterium Exchange NMR Spectroscopy. 2011.

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