Development of inhibitory peptides against the NS2-3 and NS3/4A proteases of the Hepatitis C Virus

Kügler, Jonas

At the outset it was planned to develop inhibitory peptides against the NS2-3 and NS3/4A proteases of the Hepatitis C Virus (HCV) as leads for drugs for HCV treatment. These proteases are essential for the viral life cycle and therefore present interesting targets for the development of new specific antiviral HCV drugs. Worldwide up to 170 million people are chronically infected with HCV (Yu and Chiang, 2010). HCV infections are the leading cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (Shepard, 2005). The standard of care achieves a sustained viral response in only about half of the patients treated and is associated with considerable severe side effects (Manns et al, 2001). In 2011, two new HCV drugs, NS3/4A protease inhibitors, were approved by the FDA (Klein and Struble, 2011; Poordad, 2011). Because of rapid resistance development the drugs can only be used in combination with the current treatment. Thus there remains an unmet need for HCV drugs for an effective treatment that can replace the standard of care with its severe side effects. Large peptides might provide an alternative binding mechanism to the small molecular weight inhibitors in development. These might be binding at alternative sites and/or because of their larger interactive surface peptides are less affected by HCV resistance mutations. In this work the combinatorial phage display peptide library CPL19YS-2 displaying large peptides was used for iterative affinity enrichment on these HCV proteases. The NS2-3 protease was produced in a form that exhibited 50% self-cleavage activity. Affinity enrichment against the NS2-3 protease led to the identification of two peptides that showed specific affinity for the NS2-3 protease. One peptide showed low inhibition of NS2-3 protease cleavage to about 70% at a concentration of 270 nM presumably due to inhibition of protease dimer formation. This is an initial indication of a direct effect on protease cleavage requiring further corroborative evidence. The NS3/4A protease was produced as a single chain construct connecting the NS3 protease domain with the NS4A co-factor (Dimasi et al., 1998). An MBP fusion increased the solubility of the protease considerably. Affinity enrichment against NS3/4A protease led to the identification of two peptides that inhibited the NS3/4A protease in the low nanomolar range. Recombination of the peptides with pre-selected populations led to the identification of peptides with increased affinity to the protease. One showing a two-fold increase in the Ki value to 5.2 nM. For optimisation of the inhibitory peptide X-ray crystallography and structural modelling were successfully implemented for the N-terminal region of the peptide. The co-crystallisation showed that the peptide covers the active site and that peptide cleavage is prevented by a sum of geometrical constraints and inhibition of the function of the oxyanion hole. Protein modelling was applied to make predictions for structural optimisation by mimicking ionic interactions of a natural substrate. One such designed variant increased affinity 10- fold to a Ki value of about 530 pM. The optimised peptide showed a negligible susceptibility to the important A156V resistance mutation of the NS3/4A protease, which is highly resistant to the small molecular weight inhibitors. This gives an initial indication that large peptides are less affected by resistance mutations. Inhibition of viral replication in cell culture was demonstrated by fusion of an inhibitory peptide to the Antp cell penetrating peptide. The efficacy of the peptide was reduced about 30-fold but it is an encouraging initial indication of intracellular inhibition of viral replication.

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung inhibitorischer Peptide gegen die NS2-3 und NS3/4A Proteasen des Hepatitis C Virus (HCV), die als Ausgangspunkt fr die Entwicklung von Medikamenten dienen k”nnen. Die HCV Proteasen sind essentiell fr den Lebenszyklus des Virus und daher interessante Ziele fr die Entwicklung neuer spezifischer Medikamente. Weltweit sind bis 170 Millionen Menschen chronisch mit HCV infiziert (Yu und Chiang, 2010). HCV Infektionen sind der Hauptgrund fr chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinom (Shepard, 2005). Die Standardbehandlung erreicht nur in ungef„hr der H„lfte der behandelten Patienten eine dauerhafte Eliminierung des Virus und ist verbunden mit zahlreichen Nebenwirkungen(Manns et al, 2001). 2011 wurden zwei NS3/4A Protease-Inhibitoren zur Behandlung von HCV zugelassen (Klein und Struble, 2011; Poordad, 2011). Da der Virus schnell Resistenzen gegen diese Inhibitoren entwickelt, ist nur eine Anwendung mit der ursprnglichen Therapie m”glich, die starke Nebenwirkungen hat. Daher besteht noch immer ein groáer Bedarf an neuen Medikamenten fr eine Behandlung, die die Standardbehandlung ersetzen k”nnen. Groáe Peptide k”nnten alternative Bindungsmechanismen bieten, verglichen mit den Kleinmolekl-Inhibitoren in Entwicklung. Dies k”nnte Bindung an alternative Stellen sein und/oder Peptide werden m”glicherweise wegen ihrer groáen Bindungsoberfl„che weniger stark von HCV Resistenzmutationen beeintr„chtigt. In dieser Arbeit wurde die Phagen Display Peptid Bibliothek CPL19YS-2, die groáe Peptide pr„sentiert, fr iterative Affinit„tsanreicherungen verwendet. Die NS2-3 Protease konnte in einer Form produziert werden, die 50% Selbstspaltungs-Aktivit„t aufwies. Mittels Affinit„tsanreicherung konnten zwei Peptide identifiziert werden, die spezifische Affinit„t fr die NS2-3 Protease zeigen. Ein Peptid reduziert bei einer Konzentration von 270 nM die Aktivit„t der Protease auf 70%, wahrscheinlich durch Verhinderung der Dimer-Bildung. Dies ist ein erster Hinweis auf eine direkte Wirkung auf die Aktivit„t der Protease, die aber noch weitergehend untersucht werden muss. Die NS3/4A Protease wurde als Fusionsprotein produziert, bei dem die NS3 Protease Dom„ne mit dem NS4A Kofaktor verbunden wurde (Dimasi et al., 1998). Eine zus„tzliche Fusion mit dem MBP Protein verbesserte die L”slichkeit der Protease erheblich. Mittels Affinit„tsanreicherung konnten zwei Peptide identifiziert werden, die die NS3/4A Protease bei Konzentrationen im unteren nanomolaren Bereich inhibieren. Rekombination der Peptide mit pre-selektierten Peptiden fhrte zu Varianten mit verbesserter Affinit„t. Eine Variante zeigte eine zweifache Verbesserung des Ki Wertes auf 5,2 nM. Fr die weitere Verbesserung des N-terminalen Bereichs des Peptids wurden R”ntgenkristallographie und Strukturmodellierung erfolgreich eingesetzt. Die Ko-Kristallisation zeigte, dass das Peptid das aktive Zentrum der Protease verdeckt und das die Spaltung des Peptids durch geometrische Beschr„nkungen und Inhibierung des ?oxyanion hole? verhindert wird. Anhand des Modells vorgeschlagene ionische Interaktionen, die denen des natrlichen Substrats „hneln, konnten die Affinit„t des Peptids 10-fach auf einen Ki Wert von 530 pM verbessern. Das optimierte Peptid zeigte nur eine geringe Anf„lligkeit fr die A156V Resistenzmutation der NS3/4A Protease, die starke Resistenz gegen Kleinmolekl-Inhibitoren bewirkt. Dies ist ein erster Anhaltspunkt dafr, dass groáe Peptide weniger stark von Resistenzmutationen beeintr„chtigt sind. Inhibition von viraler Replikation in Zellkultur konnte mittels Fusion an das zellpenetrierende Peptid Antp gezeigt werden. Die Wirksamkeit des Peptids war ca. 30-fach verringert, aber es ist ein erster viel versprechender Befund fr eine intrazellul„re inhibitorische Wirkung.




Kügler, Jonas: Development of inhibitory peptides against the NS2-3 and NS3/4A proteases of the Hepatitis C Virus. 2011.


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