Biosynthese des Isobakteriochlorins Häm d1: Charakterisierung der Proteine NirJ und NirDLGH aus Pseudomonas aeruginosa

Walther, Johannes Marten

In der vorliegenden Arbeit wurde erfolgreich NirJ aus Hydrogenobacter thermophilus als Eisen-Schwefel-Protein charakterisiert. Anschließend wurde mittels Eisen- und Schwefelbestimmungen gezeigt, dass ein [4Fe-4S]2+ -Zentrum pro NirJ vorliegt. UV/Vis-spektroskopische Untersuchungen unterstützten diesen Befund. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit die Proteine NirDLGH aus P. aeruginosa charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Einzelproteine NirD, NirL, NirG und NirH als Homodimere vorliegen. Interessanterweise konnte ebenfalls das Auftreten von heterodimeren Proteinkomplexen NirD/L bzw. NirG/H gezeigt werden. Ein tetramerer Komplex wurde nicht beobachtet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels Primer-Extension-Analyse gezeigt, dass sich im nir-Operon von P. aeruginosa -42 bp upstream von nirJ ein Transkriptionsstartpunkt befindet. Dies deutet auf das Vorhandensein eines separaten nirJEN-Transkripts hin. Durch lacZ-Reportergenfusionen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität des neu entdeckten nirJ-Promotors unter anaeroben Wachstumsbedingungen und in Gegenwart von Nitrat im Vergleich zu aeroben Bedingungen um das Dreifache induziert wird. Die Induktion erfolgt dabei durch die Proteine NirDLGH. Des Weiteren konnte durch Gelretardationsexperimente eine Bindestelle für die Proteine NirDLGH ca. -85 bp upstream von nirJ identifziert werden. Dabei wurden die Einzelproteine NirL und NirH bzw. die Proteinkomplexe NirD/L und NirG/H als DNA-bindende Proteine identifiziert. Diese Tatsache konnte mittels initialer DNaseI-Protektionsanalysen verifiziert werden. Somit konnte gezeigt werden, dass es sich bei den Proteinen NirDLGH aus P. aeruginosa um Transkriptionsfaktoren handelt. Es sei erwähnt, dass eine zusätzliche enzymatische Funktion der Proteine durchaus denkbar wäre. Das Protein NirDL aus H. thermophilus wurde erfolgreich kristallisiert. Ein Datensatz mit einer Auflösung von 3.2 A konnte aufgenommen werden.

In this study it was possible to produce and purify recombinant NirJ from Hydrogenobacter thermophilus. Through iron and sulfur determination it was shown that this protein contains one [4Fe-4S]2+ cluster per molecule. This finding was substantiated by UV/Vis-spectroscopy. Yet, it was not possible to assign any enzymatic function to NirJ using an in vitro activity assay. Further, the recombinant proteins NirD, NirL, NirG and NirH from P. aeruginosa were produced and purified to homogeneity revealing heterodimeric protein complexes between NirD/L and between NirG/H. The individual proteins NirD, NirL, NirG and NirH were shown to be homodimeric. Using primer extension analysis a so far unrecognized transcription start site located 42 bp upstream of the P. aeruginosa nirJ gene was identified, indicating the presence of a separate nirJEN transcript. Using lacZ-reporter gene fusions it was shown that the expression of lacZ, which was placed under the control of the nirJ promoter, was increased by 3-fold under anaerobic growth conditions in the presence of nitrate relative to the level observed under aerobic growth conditions. P. aeruginosa NirDLGH were required for the anaerobic induction of the nirJ promoter. DNA retardation assays and DNaseI footprinting proved that NirL, NirH, NirD/L and NirG/H bind to DNA in a region approx. 85 bp upstream of nirJ. Thus, the role of NirDLGH as transcription regulators in P. aeruginosa could be shown. It should be mentioned that an enzymatic function of those proteins as discussed in Chapter 3 might be feasible as well. The H. thermophilus protein NirDL was crystallized. It was possible to record a data set with a resolution of up to 3.2 A. The structure is being solved at the Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig in cooperation with Dr. Stefan Schmelz.

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Walther, Johannes Marten: Biosynthese des Isobakteriochlorins Häm d1: Charakterisierung der Proteine NirJ und NirDLGH aus Pseudomonas aeruginosa. 2011.

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