Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Mikroarrays für die diagnostische und analytische Anwendung

Grote-Koska, Denis

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Mikroarrays mit Hinblick auf den klinischen Einsatz. Für die Herstellung von Faden-Arrays wurden Fäden mit daran gebundenen Sondenmolekülen zu einem Bündel verdreht, um daraus einheitliche Querschnitte zu erzeugen. Die so erhaltenen Querschnitte ergeben eine Vielzahl gleicher Exemplare von Mikroarrays. Als Material für die Fäden wurde Lyocell verwendet. Unter anderem sind Stabilität, Funktionalisierbarkeit und Permeabilität des Materials gegenüber einer Auswahl zu immobilisierender Moleküle getestet worden. Sowohl mit dem Sondenmolekül Biotin, als auch mit einem bekannten Peptid-Epitop als Sonde sind 7er Faden-Arrays für Proteinbindungstests generiert worden. In beiden Fällen konnte die spezifische Detektion der Sonde durch Bindung zu einem fluoreszenzmarkierten Protein gezeigt werden. Mit diesen Versuchen ist die prinzipielle Funktionalität des neuen Faden Arrays erfolgreich belegt worden. Als biologisch sinnvolles Modell ist eine neue Bibliothek potentieller Sondenmoleküle synthetisiert worden. Als Beispiel wurden Purine gewählt. Es ist eine Synthesestrategie für 2,6,9 trisubstituierte Purine an planarer Cellulose als fester Phase entwickelt worden. Für jeden der drei Substitutionsschritte an dem Puringerüst konnten durch Einsatz eines Mikrowellenofens kurze Reaktionszeiten bei hohem Umsatz erzielt werden. Die kombinatorische Synthese von 384 Purinen erfolgte mittels der Cut & Combine Methode. Über den SC²-Prozess sind daraus Mikroarrays in einem bekannten Format hergestellt worden, an Hand derer Bindungstests gegen Kinasen durchgeführt worden sind. Für p38a MAPK konnte dabei eine Bindung zu zwei strukturell ähnlichen Purinen der Bibliothek gefunden werden.

Aim of this work was die development of a novel manufacturing process for microarrays. Probe molecule presenting fibres werde bundled to produce identical slices. Those represent a large number of identical microarrays. As a material lyocell fibres were used. Some of the tests were regarding the stability, functionalisability and permeability of the fibres against a selection of potential probe molecules. Either with biotin as a probe and with a known peptide epitope fibre-arrays consisting of 7 feature positions have been developed for protein binding assays. In both cases the specific detection of the probe by binding to a labeled protein could be demonstrated, representing the proof of principle for the new array format. As an example for a biological application a novel small molecule library of purines has been synthesized. A synthetic strategy for 2,6,9-trisubstituted purines on planar cellulose membranes as a solid phase was developed. Each of three substitutions resulted in quite short reaction steps and high conversion, due to the application of a microwave oven. The combinatorial synthesis of 384 purines was successfully performed via the Cut & Combine method. By SC²-process the library was converted into microarrays of a known format which were used for binding assays against kinases. In case of p38a MAPK an interaction with two similar compounds oft the purine library could be detected.

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Grote-Koska, Denis: Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Mikroarrays für die diagnostische und analytische Anwendung. 2011.

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