Erzeugung von Amylosucrase-Enzymvarianten mit neuen katalytischen Eigenschaften unter Verwendung von neu konstruierten Produktionsstämmen

Schneider, Jens Hinnerk

Amylosucrase (AS) aus Neisseria polysaccharea katalysiert den Transfer von Glucose-Resten aus Saccharose (Sac) auf eine wachsende Glucosekette. Für dieses Enzym wurden zwei effiziente E.-coli-Expressionssysteme entwickelt. Über einen His-tag konnte die AS einfach gereinigt werden. Das Enzym war in der Lage, auch das Sac-Analogon Allosaccharose langsam zu hydrolysieren und den Allosylrest auf Arbutin als Akzeptor zu übertragen. Es wurden gezielt AS-Varianten erzeugt, in denen die Aminosäure (AA) Tyr147 gegen AA mit verschiedenen Typen von Seitenketten ausgetauscht war. Die z. T. drastische Verringerung der katalytischen Aktivität zeigte die wichtige Rolle dieser AA. Ein Umsatz der Sac-Analoga Allo-, Galacto-, Manno- oder Xylosaccharose wurde nicht festgestellt. Verschiedene Banken von AS-Varianten wurden durch statistische Mutagenesen in fünf Segmenten hergestellt, welche für je vier bis sechs im Aktiven Zentrum oder in dessen unmittelbarer Umgebung liegende AA codieren. Ein Screening von ca. 45.000 dieser Klone auf Allosaccharose-Umsatz ergab lediglich falsch-positive Treffer. In einem zweiten Screening wurden die Varianten-Banken auf Defizienz in der Polymerbildung untersucht. Dabei wurden in einer der Banken Varianten gefunden, die nicht mehr in der Lage waren, Produkte mit mehr als drei Glucose-Einheiten zu bilden. Die Ermittlung der ausgetauschten AA deutete darauf hin, dass hauptsächlich Substitutionen in den Positionen 394 und 396 zur Limitierung der Elongationsfähigkeit beitragen. Die strukturelle Modellierung von fünf Varianten spricht dafür, dass die veränderten Eigenschaften hauptsächlich das Ergebnis sterischer Interferenzen in den subsites +1 bis +3 zwischen der wachsenden Glucosekette und AA-Seitenketten an diesen beiden Positionen sind.

Amylosucrase (AS) from Neisseria polysaccharea catalyzes the transfer of glucose moieties from sucrose (Suc) onto a growing glucan chain. Two high-level E.-coli-based expression systems were constructed. The recombinant AS was rapidly purified through the use of attached histidine tags. The enzyme was able to slowly hydrolyze the Suc analogue allosucrose and to transfer the allosyl moiety onto arbutin as an acceptor. AS variants were generated where the amino acid (AA) Tyr147 was replaced by residues with different types of side chains. The drastic decrease of the catalytic activity of some of these variants demonstrated the important role of this AA. Turnover of the Suc analogues allo-, galacto-, manno- or xylosucrose was not detected. Various banks of variants were generated using random mutagenesis that targeted five segments around the active site that encode four to six AAs. Screening of ca. 45,000 clones for allosucrose turnover yielded, however, only false-positives. A second screen was carried out to identify enzyme variants compromised in unlimited glucan chain elongation. A detailed characterization of selected variants of one of the banks revealed that elongation terminated when chains reached lengths of only two or three glucose moieties. Identification of the AA substitutions suggested that predominantly exchanges of Asp394 or Gly396 were responsible for the limitations of glucosyl transfers. Structural models of five variants indicated that steric interference at subsites +1 to +3 between the growing oligosaccharide chain and the AAs introduced at these positions were crucial for the novel properties.

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Schneider, Jens Hinnerk: Erzeugung von Amylosucrase-Enzymvarianten mit neuen katalytischen Eigenschaften unter Verwendung von neu konstruierten Produktionsstämmen. 2011.

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