Untersuchungen zur Funktion von MutLgamma und MutSgamma in humaner DNA-Mismatch-Reparatur

Rösner, Lennart Matthias

Mutationen der humanen Mismatch-Reparaturgene stellen die Ursache der erblichen Darmkrebsform Lynch Syndrom/HNPCC dar. Mismatch-Reparatur (MMR) erkennt und korrigiert post-replikativ Fehler in der DNA-Sequenz, wobei die Proteinheterodimere MutSalpha und –beta sowie MutLalpha als essentiell für die Reparatur beschrieben sind. Den darüberhinaus bekannten Heterodimeren der MMR-Familie MutSgamma (MSH4/MSH5) und MutLgamma (MLH1/MLH3) werden in humanen Zellen dagegen Funktionen in der Meiose und in crossing-over-Ereignissen zugeschrieben. Arbeiten mit MMR-spezifischen Knockout-Mäusen lassen vermuten, dass diese gamma-Heterodimere einen Funktionsverlust der alpha/beta-Heterodimere kompensieren können und so ein Backup-System darstellen. In humanen Zellen konnte diese Redundanz bisher nicht gezeigt werden, obwohl hohe Sequenzhomologien bekannt sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals erfolgreich ein stabil exprimierendes Untersuchungssystem für MutSgamma und MutLgamma etabliert. Die Fusion mit Fluoreszenzproteinen ermöglichte eine Untersuchung der Funktion der gamma-Heterodimere in vivo in humanen Zellen. Nach Induktion von DNA-Schäden durch laservermittelte UVA-Strahlung, wurde eine Akkumulation von MLH3 mittels live cell imaging beobachtet. Eine Funktion von MutLgamma in MMR wurde anhand der Auslösung eines spezifischen Zellzyklusarrests, der aus aktiver Reparatur resultiert, untersucht. Dazu wurden Einzelklone der MMR-defizienten Zelllinie 293T, die durch rekombinante Expression von MutLalpha oder MutLgamma rekonstituiert wurden, vergleichend eingesetzt. Während über die Expression von MutLalpha die Reparaturfunktion und die Auslösung des Zellzyklusarrests wiederhergestellt werden konnte, konnte nach Expression von MutLgamma kein Einfluss auf den Zellzyklus detektiert werden. Im Gegensatz zu murinen Zellen sind daher eine Redundanz zwischen MutLgamma und MutLalpha sowie eine Backup-Funktion durch das gamma-Heterodimer in humanen Zellen nicht nachweisbar.

Mutations in human mismatch repair genes are the hallmark of Lynch Syndrome/HNPCC. Mismatch repair (MMR) functions in detection and repair of DNA errors, resulting from incorrect replication. While the protein heterodimers MutSalpha and –beta as well as MutLalpha are well known key players of MMR, reported functions of the heterodimers MutSgamma (MSH4/MSH5) and MutLgamma (MLH1/MLH3) are limited to meiosis and crossing-over in human cells. Recent data from knockout-mice suggest that in murine cells these gamma-heterodimers may function as a backup-system for the alpha/beta-heterodimers. This function could not be shown in human cells so far, although wide sequence homologies have been reported. This work describes for the first time a model system of cells, stably expressing MutSgamma and MutLgamma in fusion with fluorescent markers. After induction of UVA-laser induced DNA damage, we observed accumulation of MutLgamma via live-cell-imaging. To investigate a function of MutLgamma in MMR, the ability to activate a MMR-specific cell cycle arrest was checked. Therefore, single clones of the MMR-deficient cell line 293T, reconstituted by recombinant expression of MutLalpha or MutLgamma were compared. While expression of MutLalpha restored repair function and activation of the cell cycle arrest, expression of MutLgamma had no effect on cell cycle. Contrary to murine cells, redundant functions of MutLalpha and –gamma as well as a backup-function by the gamma-heterodimer are not detectable in human cells.

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Rösner, Lennart Matthias: Untersuchungen zur Funktion von MutLgamma und MutSgamma in humaner DNA-Mismatch-Reparatur. 2011.

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