Alanyl-Phosphatidylglycerol Synthase from Pseudomonas aeruginosa: Physiological relevance and mechanism of tRNA-dependent catalysis

Hebecker, Stefanie

Aminoacyl-phosphatidylglycerol synthases catalyze the tRNA-dependent modification of phosphatidylglycerol (PG) with Ala, Lys and Arg, respectively. However, the exact biological roles and catalytic mechanisms of these enzymes were poorly understood. In this study, the Ala-PG formation in P. aeruginosa PAO1 was investigated. Analysis of the membrane composition of the bacterium grown under acidic conditions revealed 6 % of Ala-PG of the total amount of phospholipids. In agreement, the corresponding PA0920 gene encoding the Ala-PG synthase (A-PGS) was found upregulated under acidic conditions. Formation of Ala-PG was found responsible for the resistance of P. aeruginosa to cefsulodin, Cr3+, sodium lactate, and protamine sulphate. In a second part of this study a P. aeruginosa A-PGS catalytic fragment was produced and employed for the elucidation of the enzymatic mechanism in vitro. Based on a site-directed mutagenesis study with 15 A-PGS mutants a direct transesterification mechanism for A-PGS catalysis was proposed. Determinants of the substrates were elucidated. The polar head group of PG is specifically recognized, whereas the fatty acid residues of PG are not important determinants. The tRNA substrate recognition does not include posttranscriptional base modifications. Besides this, only the acceptor stem of the tRNA is recognized. Based on A-PGS activity assays with tRNA microhelices it was speculated that 5 of the terminal base pairings and especially the C5-G68 base pair are required to direct the alanyl-moiety of Ala-tRNAAla into the active site of the enzyme. Electron microscopic analysis revealed a homogeneous distribution of P. aeruginosa A-PGS in the cytoplasmic membrane. Finally, the localization of the C-terminus of the membrane protein which is relevant for A-PGS activity was determined. Obtained results provided first significant insights into the enzymatic mechanism of A-PG formation which provide a basis for development of A-PGS inhibitory molecules.

Aminoacyl-Phosphatidylglycerol-Synthasen katalysieren die tRNA-abhängige Modifikation von Phosphatidylglycerol (PG) mit Ala, Lys bzw. Arg. Die biologische Funktion und der katalytische Mechanismus dieser Enzyme sind unzureichend verstanden. In dieser Studie wurde die Bildung von Ala-PG in P. aeruginosa PAO1 untersucht. Die Analyse der Lipidzusammensetzung nach Kultivierung unter sauren Bedingungen zeigte 6 % Ala-PG in Relation zur Phospholipid-Gesamtmenge. In Übereinstimmung dazu, war die Transkription des Gens PA0920, das die Ala-PG-Synthase (A-PGS) kodiert, unter sauren Bedingungen erhöht. Die Bildung von Ala-PG ist zuständig für die Resistenz von P. aeruginosa gegenüber Cefsulodin, Cr3+, Natriumlaktat und Protaminsulfat. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein katalytisches Fragment der P. aeruginosa A-PGS für die Untersuchung des enzymatischen Mechanismus unter in vitro Bedingungen produziert. Basierend auf einer zielgerichteten Mutagenesestudie mit 15 A-PGS-Mutanten wurde eine direkte Transesterifikation als Mechanismus der A-PGS Katalyse vorgeschlagen. Desweiteren wurden Determinanten der Substraterkennung untersucht. Die polare Kopfgruppe des PG wird spezifisch erkannt, die Fettsäurereste stellen keine wichtige Determinate dar. Die Erkennung der tRNA umfasst keine posttranskriptionellen Basenmodifikationen und lediglich der Akzeptorstamm wird erkannt. A-PGS Aktivitätstests mit tRNA-Mikrohelices zeigten, dass 5 der terminalen Basenpaarungen, im speziellen die Paarung C5-G68 notwendig sind, um den Alanylrest der Ala-tRNAAla im aktiven Zentrum des Enzyms zu positionieren. Elektronenmikroskopische Analysen zeigten eine homogene Verteilung der P. aeruginosa A-PGS in der Cytoplasmamembran. Die Lokalisation des für die Aktivität des Membranproteins A-PGS relevanten C-Terminus wurde bestimmt. Die erzielten Ergebnisse liefern erste Einblicke in den enzymatischen Mechanismus der A-PG Synthese und stellen eine Basis für die Entwicklung von A-PGS-inhibierenden Molekülen dar.

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Hebecker, Stefanie: Alanyl-Phosphatidylglycerol Synthase from Pseudomonas aeruginosa: Physiological relevance and mechanism of tRNA-dependent catalysis. 2011.

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