Development of genetic tools for large-scale deletions and streamlining of a Pseudomonas putida strain.

Leprince, Audrey

Während der letzten Dekaden wurde die weisse Biotechnologie weiterentwickelt und viele Bakterien wurden für verschiedene Ziele verwendet (z.B. die Erstellung chemischer Verbindungen). Unter diesen bieten die Pseudomonas putida Spezies nützliche natürliche Eigenschaften, wie z.B. die mikrobiologische Sanierung von verunreinigten Erdböden. Trotz der vollständig sequenzierten Genome sind noch viele Gene mit nicht charakterisierter Funktion vorhanden (z.B. hypothetische oder konserviert hypothetische Funktion), die bei der Manipulation von Bakterien Instabilität hervorrufen können. Desweiteren werden einige Gene mit charakterisierter Funktion als nicht essentiell für bestimmte Laborbedigungen betrachtet. Um die Komplexität zu minimieren und das Genom stabiler zu machen, wurde dieses durch zufällige Deletion von Chromosomfragmenten reduziert. Während der Doktorarbeit sollte die Reduktion des 6,18 Mbp großen Genomes des P. putida Stammes TEC1 unter spezifischen Laborbedingungen durchgeführt werden. Hierfür wurde eine Kombination aus zufälliger Insertion zweier modifizierter mini-Tn5 Mini-Transposons und des Flp-FRT ortsspezifischen Rekombinationssystemes aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae angewandt. Nach einem ersten Insertions- und Deletions- bzw. Rekombinationsereignisses wurde die Größe des Genoms von P. putida TEC1 bereits um 4,1 % reduziert. Eine Wiederholung führte zur Vergrößerung des deletierten Bereiches und somit zur Erzeugung der P. putida Doppelmutante 2, bei der 4,8 % ihres Genomes deletiert wurden. Erste genetische und metabolische Analysen der Mutante bestätigten bereits in silico vorhergesagte essentielle Gene, ferner wurden neue potentielle Seitenzweige bestimmter Stoffwechselwege offenbart. Diese Studie ermöglichte die Etablierung einer kombinatorischen Methode zur Optimierung eines P. putida Stammes, wodurch sich neue Erkenntnisse über die Funktion von Genen und Stoffwechselwege bieten.

In the last decades, the white biotechnology was highly developed and many bacteria were used for diverse purposes (e.g. production of chemical compounds). Among them the Pseudomonas putida species provided good natural candidates, for example for the bioremediation of polluted soils. Despite the fully sequenced genomes, several genes remain of uncharacterized function (code for hypothetical and conserved hypothetical proteins as well as for proteins of unknown functions) and create instability during the manipulation of the bacteria. Furthermore some genes with characterized functions are considered (experimentally proved or predicted in silico) as being non essential under specific laboratory conditions (e.g. certain redundant genes). In order to reduce the complexity and to render the genome more stable, the idea was developed to reduce the genome size by removing random fragments from the chromosome. The PhD work was initiated on the reduction of the 6.18 Mbp genome from P. putida strain TEC1 (uracil auxotroph from strain KT2440) under specific laboratory conditions. For this purpose a combination of random insertions, using two modified mini-Tn5 mini-transposons, and the Flp-FRT site specific recombination system (from the yeast Saccharomyces cerevisiae) was applied. After a first round of insertion and deletion/recombination events the genome of P. putida TEC1 was reduced by 4.1% of its size. The repetition of these events increased the first deletion and generated a double-deleted P. putida Δ2 mutant that lost 4.8% of its genome. The first genetic and metabolic analyses of the mutant confirmed the presence of in silico predicted essential genes but revealed also potential new branches of certain metabolic pathways. This study allowed the establishment of a combinatorial method for streamlining a P. putida strain, which offers new insights into the function of the genes and the metabolic pathways.

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Leprince, Audrey: Development of genetic tools for large-scale deletions and streamlining of a Pseudomonas putida strain.. 2010.

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