Chip-basierte Systeme zum Nachweis von RNA- und DNA-Viren

Hild, Katharina

Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden immunologische und molekularbiologische Biochip-Nachweise für Viren, welche als potentielle biologische Waffen angesehen werden, aufgebaut, getestet und optimiert. Die Besonderheit des benutzten Microarray-Systems besteht in der Tatsache, dass die gesamte Nachweis-Reaktion in einer Kartusche mit integriertem Biochip unterbrechungsfrei abläuft und dass die Kartusche – je nach immobilisiertem Fängerset – sowohl für die immunologische als auch molekularbiologische Identifikation von Viren genutzt werden kann. Der immunologische Nachweis auf Basis eines klassischen Sandwich-ELISAs von Alpha- und Orthopockenviren gelang innerhalb von 30 Minuten mit Nachweisgrenzen pro Kartusche von 500 bzw. 200000 infektiösen Einheiten für VacV bzw. VEEV. Der Zeitbedarf für diese molekularbiologische Identifikation der Alpha-, Flavi- und Orthopockenviren betrug anderthalb bis zwei Stunden. Die Titrationen der einzelnen Viren ergaben abhängig vom nachzuweisenden Genabschnitt Nachweisgrenzen im Bereich zwischen 10 und 100 Genomkopien pro Ansatz. Anders als in anderen Biochip-Systemen erfolgt der molekularbiologische Nachweis in dem hier vorgestellten System als direkte Kombination von Nukleinsäureamplifikation und Hybridisierung an die spezifischen Fängersonden. Für diesen unterbrechungsfreien Reaktionsablauf wurde einerseits die Enzym-, Magnesiumchlorid- und Primerkonzentration im Reaktionsmix und andererseits die Temperatur- und Zeitparameter der Prozessierungsbedingungen optimiert. Zusätzlich erfolgte die Weiterentwicklung und Verbesserung der Oligonukleotidsonden für eine sensitive und spezifische Identifizierung verschiedener Virusstämme einer Virusgattung. Für alle untersuchten Alpha-, Flavi- und Orthopockenviren konnten spezifische, signalintensive Nachweise für das Biochip-Format etabliert werden. Ein Parallelnachweis von bis zu drei verschiedenen Viren ist zeitgleich auf dem Biochip mit ausreichenden Sensitivitäten möglich.

Within the scope of the present PhD thesis we established, tested and optimized immunological and molecular biochip assays for viruses, which were regarded as prospective biological warfare agents. The specific characteristic of the used microarray system consists in the fact that the whole detection reaction proceeds without interruption inside a cartridge with an integrated biochip. The cartridge can be deployed – depending on the immobilized capture set – either for the immunological or molecular identification of viruses. The immunological analysis of alpha- and orthopoxviruses on the basis of a classical sandwich ELISA succeeded within 30 minutes and resulted in detection limits of 500 and 200000 infectious virus particles per cartridge for VacV and VEEV respectively. The molecular assay for the viral identification of alpha-, flavi- and orthopoxviruses required one and a half to two hours. The titrations of the individual viruses resulted in detection limits between 10 to 100 genome copies per cartridge dependent on the analyzed gene sequence. In comparison to other biochip-systems the molecular identification proceeds inside the introduced AP-system as a direct combination of nucleic acid amplification and hybridization to specific capture probes. For this non-interruptable reaction process the enzyme-, magnesium chloride- and the primer- concentration of the reaction mix as well as the temperature and time parameters of the processing conditions were optimized. Additionally, the oligonucleotide probes were refined and improved for a sensitive and specific identification of several viral strains of one virus genus. Specific and signal-intensive assays for the biochip format could be established for the examined alpha-, flavi and orthopoxviruses. The parallel detection of up to three viruses on the biochip is simultaneously feasible with adequate sensitivities.

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Hild, Katharina: Chip-basierte Systeme zum Nachweis von RNA- und DNA-Viren. 2010.

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