Untersuchungen an fluoreszenzmarkierten Enzymvarianten der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase

Haase, Tobias Dietrich

Die Untereinheiten der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase wurden mit fluoreszierenden Proteinen markiert und im Sf9/Baculovirus System exprimiert. Durch die Messung von FRET zwischen den fluoreszierenden Proteinen konnte eine räumliche Nähe zwischen den fluoreszierenden Proteinen am Carboxy- und Aminoterminus der Untereinheiten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sprechen für eine räumliche Nähe zwischen den regulatorischen- und katalytischen Domänen des Enzyms. Aufgrund dieser Befunde wurden die Untereinheiten der Guanylyl-Cyclase zwischen ß1 Carboxyterminus und a Aminoterminus mittels eines fluoreszierenden Proteins fusioniert. Diese monomeren Guanylyl-Cyclase Fusionsproteine bildeten nach rekombinanter Expression funktionsfähige Enzymkomplexe, wobei auch das fluoreszierende Protein seine biophysikalischen Eigenschaften behielt. Die fluoreszenten Fusionsproteine erlauben die isoformspezifische rekombinante Expression des Enzyms ohne die Bildung von inaktiven Homodimeren. Mithilfe der fluoreszenzmarkierten Fusionsproteine konnte eine unterschiedliche Lokalisation der Enzymisoformen in HEK 293-Zellen nachgewiesen werden. Während die a1-Isoform cytosolisch vorlag, war die a2-Isoform spezifisch an Membranabschnitten mit Zell-Zell Kontakt lokalisiert. Untersuchungen an mutierten Varianten der Fusionsproteine zeigten, dass diese Lokalisation durch die carboxyterminale PDZ Erkennungssequenz der a2-Untereinheit vermittelt wird.

To examine the structural organisation of heterodimeric soluble guanylyl cyclase (sGC) Förster resonance energy transfer (FRET) was measured between fluorescent proteins fused to the amino- and carboxy-terminal ends of the sGC ß1 and a subunits. Detection of energy transfer between the fluorescent proteins at the amino-terminus and carboxy-terminus of the dimerising partner subunits indicated a close proximity between the regulatory and catalytic domains of the enzyme. These findings support the concept of a "trans" regulation of sGC activity by the H-NOX domains through direct interaction of the amino-terminal regulatory domains with the carboxy-terminal catalytic region. To support this concept of domain arrangement in the heterodimeric enzyme we constructed fusion proteins where both subunits are connected between the a amino-terminus and the ß1 carboxy-terminus by a fluorescent protein. The resulting constructs were not only fluorescent; they also showed preserved enzyme activity and regulation by NO. These "fluorescent-conjoined" sGC's represent to our knowledge the first example where a fluorescent protein links two different subunits of a higher ordered complex to yield a stoichometrically fixed functionally active monomer. The fluorescent fusion proteins allow the isoform specific expression of the recombinant enzyme without the formation of inactive homodimers. Using the fluorescently labeled fusion proteins we could show a different subcellular localization of the enzyme isoforms in HEK 293 cells. While the a1 isoform showed a cytosolic localization, the a2 isoform was specifically localized at membrane sections with cell-cell contact. Studies of mutant variants of the fusion proteins showed that this localization is mediated by the carboxy-terminal PDZ recognition sequence of the a2 subunit.

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Haase, Tobias Dietrich: Untersuchungen an fluoreszenzmarkierten Enzymvarianten der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase. 2010.

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