Die funktionelle Charakterisierung des anaeroben Regulators Fnr und die Regulation der anaeroben Genexpression in Bacillus subtilis

Gruner, Ines Dorothee

Der Redoxregulator Fnr aus Bacillus subtilis ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor in der Anpassung an die Anaerobiose dieses Organismus. Dieses Arbeit besteht aus 3 Teilen: Teil A und B beschreibt die biochemische Charakterisierung des B. subtilis Fnr und einem mutiertem Fnr aus Geobacillus stearothermophilus (FnrCCCC); Der Teil C beschreibt die anaerobe Genregulation durch Fnr aus B. subtilis. Ergebnisse: i) Das Fnr besitzt im aktiven Zustand ein über drei Cysteinreste koordiniertes [4Fe-4S]2+-Zentrum. Dieser Teil beschreibt die Funktion des Aspartatrest an Position 141 im Fnr-Protein, als vierter Ligand des [4Fe-4S]2+-Zentrums. ii) Die Aminosäurereste R189 und E190 im Helix-Turn-Helix-Motiv des B. subtilis Fnrs wurden als essentielle Kontaktstellen für die Bindung an die DNA identifiziert. iii) Ein Loop (AS 61-65) in der Struktur des Fnrs wurde identifiziert, der über die Aminosäurereste Asp63 und Gly64 einen direkten Kontakt zu der RNA-Polymerase eingeht und darüber die Transaktivierung vermittelt. iv) Untersuchungen zur Promotorstruktur anaerob induzierter Gene aus B. subtilis zeigten, dass die genaue Positionierung der palindromischen Sequenz des Fnrs bei -40,5 bzw. -41,5 wichtig für die Fähigkeit der Transaktivierung durch Fnr ist. v) Die ResE*- und ResD-Protein aus B. subtilis, sowie das FnrCCCC aus Geobacillus stearothermophilus konnte in dieser Arbeit erfolgreich rekombinant produziert und gereinigt werden. vi) Eine weitergehende Charakterisierung des FnrCCCC aus G. stearothermophilus, zeigte dass auch dieses Fnr im inaktiven und aktiven Zustand als ein Homodimer vorliegt, welches ein [4Fe-4S]2+-Zentrum pro Monomer beinhaltet. Weiter erkennt das Fnr aus G. stearothermophilus, die gleiche palindromische DNA-Bindesequenz wie das Fnr aus B. subtilis. Erste Kristallisationsversuche mit dem Fnr aus G. stearothermophilus führten zu kristallinen Nadeln und Plättchen, die jedoch noch nicht für die Strukturauflösung geeignet waren.

The Bacillus subtilis redoxregulator Fnr is an important factor during adaptation to the anaerobiosis of this organism. This work consists of 3 parts: parts A and B describe the biochemical characterization of Fnr from B. subtilis and mutant Fnr from Geobacillus stearothermophilus (FnrCCCC); while part C describes anaerobic gene regulation by Fnr in B. subtilis. Main findings: i) In the active state Fnr contains a [4Fe-4S]2+ cluster which is coordinated by 3 cysteine residues. This part describes the function of the aspartate residue 141 in the Fnr protein as the fourth ligand of the [4Fe-4S]2+ cluster. ii) The amino acid residues R189 and E190 in the helix-turn-helix motif of Fnr were identified as essential contact points for DNA binding. iii) A loop structure (AA 61-65) in the Fnr protein was identified which contacts the RNA polymerase by the residues D63 and G64 and mediates the transactivation by this. iv) Investigations to promoter structure of anaerobic induced genes of B. subtilis determined that the palindromic sequence, which is recognized by Fnr, must be in the promoter sequence at position -40,5 resp. -41,5 to enable the transactivation by Fnr. v) This work also describes the successful recombinant overproduction and purification of the ResE*- and ResD proteins of B. subtilis, and FnrCCCC of G. stearothermophilus. vi) A more in deep characterization of FnrCCCC of G. stearothermophilus shows a dimeric conformation of this Fnr protein for the active and inactive state. This FnrCCCC protein also contains a [4Fe-4S]2+ cluster per monomer and recognizes the same palindromic DNA binding sequence as described for the Fnr of B. subtilis. First crystallization attempts with the Fnr of G. stearothermophilus led to crystalline needles and platelets which were not useful for structure determination.

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Gruner, Ines Dorothee: Die funktionelle Charakterisierung des anaeroben Regulators Fnr und die Regulation der anaeroben Genexpression in Bacillus subtilis. 2010.

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