Benzoic acid metabolism in Sorbus aucuparia cell suspension cultures

Mamdoh Magdy Nashed Gaid, Mariam

In cell cultures of Sorbus aucuparia (Rosaceae), the activities of benzoic acid biosynthetic enzymes were co-ordinately stimulated by chitosan treatment, resulting in accumulation of the biphenyl phytoalexin aucuparin. The carbon skeleton of this inducible defence compound is formed by biphenyl synthase (BIS) from benzoyl-CoA and three molecules of malonyl-CoA. The formation of benzoyl-CoA proceeds via benzaldehyde as an intermediate. Benzaldehyde dehydrogenase (BD) converts benzaldehyde to benzoic acid. The preferred substrate for BD was benzaldehyde (Km = 49 µM). BD activity was dependent on the presence of NAD+ as a cofactor (Km = 67 µM). The enzyme was inhibited by divalent cations, with Cu2+ and Zn2+ being most inhibitory. Benzoic acid is activated by CoA ligase. Using a homology-based approach, a cDNA encoding CoA ligase was cloned. The enzyme shared 71 and 63.5% identities with Sa4CL2 and Sa4CL3, respectively. The highest catalytic efficiencies were found with p-coumaric and caffeic acids. Using radioisotopic assays, the lack of affinity for benzoic acid was demonstrated. Thus, the enzyme was identified as 4CL isoenzyme (Sa4CL1). Its activity was strictly dependent on the presence of a divalent cation, preferably Mg2+. After elicitor treatment, the transcript levels of all three Sa4CLs increased, however, their maximum mRNA levels were lower than the expression rates observed for the L-phenylalanine ammonia-lyase and BIS1 genes. Sa4CL3 and PAL transcripts also accumulated in response to light treatment, whereas BIS1 expression was not affected by irradiation. A fragment of a fourth cDNA encoding CoA ligase was isolated. A full-length cDNA encoding aldehyde dehydrogenase was cloned. The 1512 bp ORF encoded a 54.8 kDa protein. SaALDH transcripts were up-regulated upon elicitation, strongly suggesting its involvement in benzoic acid metabolism. A full-length cDNA encoding PAL with an ORF of 2160 bp was also cloned from elicitor-treated cell cultures.

In Zellkulturen von Sorbus aucuparia (Rosaceae) wurden nach Behandlung mit Chitosan die Aktivitäten von Benzoesäure-bildenden Enzymen koordiniert stimuliert, was zur Akkumulation des Biphenyl-Phytoalexins Aucuparin führte. Der Kohlenstoffgrundkörper dieses induzierbaren Abwehrstoffs wird von der Biphenylsynthase (BIS) aus Benzoyl-CoA und drei Molekülen Malonyl-CoA gebildet. Benzoyl-CoA wird über die Zwischenstufe des Benzaldehyds gebildet, wobei Benzaldehyd von der Benzaldehyd-Dehydrogenase (BD) in Benzoesäure umgewandelt wird. Das bevorzugte Substrat der BD ist Benzaldehyd (Km = 49 µM). Die Aktivität der BD ist abhängig von NAD+ als Co-Faktor (Km = 67 µM). Durch divalente Kationen wird das Enzym gehemmt, am stärksten durch Cu2+ und Zn2+. Benzoesäure wird durch eine CoA-Ligase aktiviert. Mit Hilfe der Homologie-Klonierung wurde eine CoA-Ligase-cDNA isoliert, die eine Sequenzidentität von 71% und 63,5% zu Sa4CL2 bzw. Sa4CL3 aufwies. Die höchste katalytische Aktivität bestand mit p-Cumarsäure und Kaffeesäure. In Radioisotop-Ansätzen wurde keine Affinität zu Benzoesäure gefunden. Demnach handelt es sich um ein 4CL-Isoenzym (Sa4CL1). Dessen Aktivität hing strikt von divalenten Kationen ab, bevorzugt Mg2+. Nach Elicitor-Behandlung stieg der Transkript-Gehalt für alle drei Sa4CLs an, aber ihre maximalen mRNA-Konzentrationen waren geringer als die Expressionsraten des L-Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL)- und BIS1-Gens. Transkripte für Sa4CL3 und PAL akkumulierten auch nach Licht-Behandlung, während die Expression von BIS1 hiervon unberührt blieb. Ein Fragment einer vierten CoA-Ligase-cDNA wurde ebenfalls isoliert, genauso wie eine Volllänge-cDNA für Aldehyd-Dehydrogenase. Der offene Leserahmen von 1512 bp kodierte für ein 54,8 kDa-Protein. Die SaALDH-Transkription wurde durch Elicitierung hochreguliert, was für eine Beteiligung am Benzoesäure-Metabolismus spricht. Außerdem wurde aus Elicitor-behandelten Zellkulturen eine PAL-Volllänge-cDNA von 2160 bp kloniert.

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Mamdoh Magdy Nashed Gaid, Mariam: Benzoic acid metabolism in Sorbus aucuparia cell suspension cultures. 2010.

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