Characterisation of Enzymes involved in Tetrapyrrole Biosynthesis

Schulz, Claudia

Während der Biosynthese katalysiert die Uroporphyrinogen III Decarboxylase die sukzessive Decarboxylierung der Uroporphyrinogen III Acetatseitenketten, um Coproporphyrinogen III zu bilden. Fehlfunktionen des Enzymes verursacht im Menschen die Krankheit Porphyria cutanea tarda. Aufgrund von Aminosäurensequenzvergleich des humanen Enzymes mit denen anderer Organismen, der Kristallstruktur des humanen Enzymes und jüngsten Dichte-Funktionsstudien der Katalyse wurden zwei hoch konservierte Argininreste vorgeschlagen, eine entscheidende Rolle in der Katalyse zu spielen. Demzufolge wurden Arg37 und Arg41 des humanen Enzymes für Funktionsuntersuchung durch gerichtete Mutagenese ausgetauscht. Der Wildtyp und die hergestellten Mutanten wurden rekombinant in E. coli produziert, gereinigt und biochemisch charakterisiert. Der enzymatische Einfluss dieser Aminosäurereste wurde durch HPLC Analyse der im Aktivitätstest gebildeten Produkte untersucht. Es wurde gezeigt, dass der Austausch von Arg37 und Arg41 die Aktivität entscheidend beeinflusst. Es konnte die Notwendigkeit der Arginine für die Substratbindung, -koordination im Aktivenzentrum und die Katalyse nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Interaktion und Existenz von Proteinkomplexen verschiedener Enzyme der ersten Schritte in der Biosynthese aus T. elongatus untersucht. Zum Schutz vor hoch-zellgiftigen Biosyntheseintermediaten wird postuliert, dass die beteiligten Enzyme Komplexe bilden, um die Intermediate untereinander weiterzuleiten. Dafür wurden die T. elongatus Gene hemB, hemD, hemE and hemN in Expressionsvektoren kloniert und die entsprechenden Proteine in E. coli recombinant produziert. HemB konnte erfolgreich chromatographisch gereinigt sowie seine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. Hingegen wurden die überproduzierten Proteine HemD, HemE und HemN ausschließlich in der unlöslichen Zellfraktion aufgefunden. Erste Ansätze zur Erhöhung der Löslichkeit dieser Proteine wurden durchgeführt.

During haem biosynthesis uroporphyrinogen III decarboxylase (HemE) catalyses the successive decarboxylation of uroporphyrinogen III acetate subunits to form coproporphyrinogen III. Dysfunction of this enzyme causes the disease porphyria cutanea tarda in humans. Based on amino acid sequence comparison of human HemE with HemE from other organisms,the crystal structure of human HemE and recently density-functional studies of the mechanism, two highly conserved arginine residues were proposed to be important for catalysis. Therefore, the arginine 37 and 41 residues of human HemE were exchanged by site-directed mutagenesis to investigate their functional role. Wild type and mutant HemE were recombinantly produced in E. coli, purified and biochemically characterised. The enzymatically influence of these residues were determined by analysing the HemE activity assay mixture by HPLC analysis. It could be shown that the exchange of the positively charged amino acids Arg37 and Arg41 abolish the enzyme activity of HemE. The necessity of the interaction of these two arginine residues for substrate binding, coordination in the active site cleft and decarboxylation was demonstrated. A second part of this thesis focused on interactions and existence of protein complexes of different enzymes involved into early steps of tetrapyrrole biosynthesis in Thermosynechococcus elongatus. For the protection of highly cell-toxic tetrapyrrole intermediates in the biosynthesis, it is proposed that the involved enzymes form complexes to channel the intermediates. Here T. elongatus hemB, hemE and hemN were cloned into expression vectors. These proteins and an already existing cloned hemD gene were recombinantly produced in E. coli. HemB was successfully chromatographically purified and enzymatic activity could be revealed. However, the overproduced protein HemD, HemE and HemN were found exclusively in the insoluble cellular extract. Initial approaches to solubilise the protein were performed.

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Schulz, Claudia: Characterisation of Enzymes involved in Tetrapyrrole Biosynthesis. 2010.

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