Charakterisierung von PDGF-induziertem peripheren und dorsalen zirkulären Membran 'ruffling'

Schloen, Kathrin

Die dynamische Reorganisation des Aktinzytoskeletts ist essentiell für die Umgestaltung der Zelloberfläche und während der Zellmigration. Die Signalwege jedoch, die zur Bildung aktinreicher Strukturen führen sind noch nicht vollständig verstanden. Zellen, die auf 2D-Oberflächen kultiviert und mit Wachstumsfaktoren behandelt werden, zeigen verschiedene Arten von ’ruffling’: zirkuläre dorsale ’ruffles’ (CDR) und periphere Lamellipodien bzw. ’ruffles’ (PR), die sich durch ihre subzelluläre Lokalisation unterscheiden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PDGF die Aktivierung verschiedener Signalmoleküle, wie der PI3-Kinase und Akt Kinase, sowie der kleinen RhoGTPasen Cdc42 und Rac zur Folge hat, und dass diese für die Bildung PDGF-induzierter CDRs benötigt werden. Überraschenderweise ist N-WASP, als direkter Interaktionspartner von Cdc42, nicht in diese Signalkaskade involviert. Dagegen konnte mithilfe von Rac1 und Nap1 RNA-Interferenz gezeigt werden, dass der Rac1-/WAVE-Komplex Signalweg essentiell für beide Arten des ’rufflings’ ist. Ferner konnte die Bedeutung des WAVE-Komplexes durch Untersuchung einer konditionalen Abi1 ’knockout’ Zelllinie bestätigt werden. Aus der detaillierten Untersuchung der Feinstruktur von CDRs und PRs geht hervor, dass es sich um strukturell sehr ähnliche Protrusionen handelt, in die in beiden Fällen zahlreiche ’microspikes’ und Filopodien eingebettet sind. Die RNAi-vermittelte Reduktion der Expression von Fascin, eines filopodialen Markerproteins, beeinflusst jedoch nur die Ausbildung zirkulärer nicht aber peripherer ’ruffles’. Auf SEM-Aufnahmen von CDRs werden segelartige Strukturen deutlich, die zur Stabilität dieser prominenten Protrusion beitragen. Dies lässt die Vermutung zu, dass die Rolle von Cdc42 die mechanische Stabilität von CDRs durch die Induktion von Filopodien/’microspikes’ über Fascin betrifft. Nicht zuletzt konnten CDRs in dieser Arbeit zum ersten mal in einer 3D-Kollagenmatrix beobachtet werden.

Dynamic actin reorganizations are essential for cell surface remodeling and protrusion events during cell migration. However, the signaling pathways eliciting these events and the composition of the machineries driving formation of the resulting structures are not fully unraveled. Tissue culture cells grown on 2D-surfaces display different types of ruffles upon growth factor stimulation, circular dorsal ruffles (CDRs) and peripheral lamellipodia and ruffles (PR), which are primarily distinguished based on their subcellular location. Here we show that PDGF treatment causes activation of the PI3-kinase and Akt kinase (PKB) as well as of the RhoGTPases Cdc42 and Rac, and that all are absolutely required for PDGF-induced CDR formation. Strikingly, Cdc42 is dispensable for PR downstream of PDGF stimulation. Surprisingly, the direct Cdc42 interaction partner N-WASP is dispensable for this process, contrasting previous reports. The Rac1/WAVE-complex pathway, as exemplified by RNAi-mediated knockdown of either Rac1 or Nap1 is essential for both peripheral and dorsal ruffling. In addition conditional knockout of the Abi1 gene confirmed the importance of the WAVE-complex in this pathway. Detailed inspection of the fine structure of CDRs versus PRs uncovered extensive similarities between both types of structures, including the presence of numerous microspikes and filopodia embedded in both types of protrusions. However, RNAi-mediated removal of the F-actin binding- and filopodial markerprotein fascin significantly affected only formation of CDRs, but not of peripheral lamellipodia. SEM revealed that these circular dorsal protrusions are stabilized by fin-like structures. Together, besides other functions, Cdc42 may regulate the mechanical stability of CDRs through signaling to filopodia/microspike formation and fascin. Finally, this work describes for the first time the occurance of CDRs under 3D-conditions in a fashion virtually identical to 2D-culture conditions.

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Schloen, Kathrin: Charakterisierung von PDGF-induziertem peripheren und dorsalen zirkulären Membran 'ruffling'. 2010.

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