Structural and Biochemical Investigation of the Yersinia enterocolitica Type III Secretion Export Apparatus

Wiesand, Ulrich Andreas Philipp

The enteric pathogen Y. enterocolitica uses a injection machinery called type III secretion system (T3SS) to translocate effector proteins across eukaryotic cell membranes. The supramolecular structure of the T3SS is evolutionarily related to the bacterial flagellum. The protein export itself is managed by the export apparatus, which is assembled by five membrane proteins YscR/S/T/U/V. Two of the proteins, YscU and YscV, consist of large cytoplasmic domains that are necessary for the export process. YscU plays an important role during assembly of the outer components, as its cytoplasmic domain (YscUc) recognizes translocators as individual substrates. Activation of YscU entails autocleavage at the amino acid sequence NPTH. Modification of this motif changes the properties of YscU including termination of translocator export and production of longer injectisome needles. The crystal structures of two uncleaved variants are determined by X-ray crystallography. NMR analysis of cleaved and uncleaved YscUc indicates that the global structure of the protein is retained in cleaved YscUc. The structures of uncleaved YscUc reveal that YscUc is poised for cleavage due to an optimal reaction geometry. In vivo analysis of YscU variants showed a new phenotype that combines the absence of translocator secretion with normal needle-length control. Comparison of YscU to homologue proteins reveals a common fold for the autocleavage domain and new structural information for the linker region. It has been proposed that the cytoplasmic domain of YscV (YscVc) and YscUc together form a platform for docking the ATPase-substrate complex. A purification scheme is established yielding pure and sufficient amounts of protein. Limited proteolysis indicated that YscVc consists of a linker region and a globular cytoplasmic domain. Although YscVc crystallizes in various conditions, X-ray analysis is not successful due to poor crystal quality.

Das intestinale Pathogen Y. enterocolitica verwendet für den Transport von Effektoren über die eukariotische Zellmembran eine Injektionsmaschine, das Typ III Sekretions System (T3SS). Die komplexe Struktur des T3SS ist evolutionär mit dem bakteriellen Flagellum verwandt. Der Proteintransport wird durch den Exportapparat, welcher aus den 5 Membranproteinen YscR/S/T/U/V besteht, gehandhabt. Zwei dieser Proteine, YscU und YscV, besitzen große cytoplasmatische Domänen, welche eine wichtige Rolle während des Proteinexports spielen. Für den Aufbau der äußeren Komponenten ist YscU entscheidend, da die cytoplasmatische Domäne (YscUc) Translokatoren spezifisch erkennt. Zur Aktivierung wird YscU in dem Aminosäuremotiv NPTH autokatalytisch gespalten. Modifikationen dieses Motivs verhindern dessen Spaltung, so dass die Translokatoren nicht mehr erkannt und exportiert werden können. Als Folge werden längere Nadeln gebildet. Die Strukturen von zwei nicht gespaltenen YscUc Varianten wurden durch Röntgenstreuung gelöst. NMR Analysen von gespaltenen und nicht gespaltenen YscUc zeigen, dass die globuläre Struktur nach der Spaltung erhalten bleibt. Die Strukturen erklären die Spaltung aufgrund der optimalen Reaktionsgeometrie. In vivo Analysen von YscU Varianten zeigen einen neuen Phänotyp, bei dem der Transport von Translokatoren verhindert wird, aber normal lange Nadeln produziert werden. Ein Vergleich der YscUc Struktur mit Homologen zeigt eine Übereinstimmung der autokatalytischen Domäne, sowie neue Bereiche des Linkers. Es wird angenommen, dass die cytosolische Domäne von YscV (YscVc) zusammen mit YscUc eine Plattform für den ATPase-Substrat Komplex bildet. Daher wurde ein Reinigungsschema für YscVc etabliert. Untersuchungen durch limitierte Proteolyse zeigen, dass YscVc aus einem Linker und einer globulären Domäne besteht. Obwohl YscVc unter einer Vielzahl von Bedingungen kristallisierte, war eine Strukturanalyse aufgrund der schlechten Kristallqualität nicht möglich.

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Wiesand, Ulrich Andreas Philipp: Structural and Biochemical Investigation of the Yersinia enterocolitica Type III Secretion Export Apparatus. 2010.

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