Etablierung eines genetischen Systems zur Funktionsanalyse von Histonen und Histonvarianten von Drosophila melanogaster

Günesdogan, Ufuk

Histone sind das Ziel von verschiedenen posttranslationalen chemischen Modifikationen, die für die Regulation der Genexpression eine Rolle spielen. Die Funktion der Histone jedoch konnte bislang nicht direkt in höheren Organismen untersucht werden, da es keine entsprechenden Histonmutanten gab. Dies lässt sich darauf zurückführen, dass die Histongene bei höheren Eukaryoten jeweils in hoher Kopienzahl und im Genom verteilt sind. Bei Drosophila melanogaster sind alle Histongene in einer distinkten Chromosomenregion, im sogenannten Histonkomplex, lokalisiert, der aus 23 sich wiederholenden Histongeneinheiten (His-GE) besteht, wobei jede Einheit für jeweils eine Kopie der Histongene codiert. Diese Genomorganisation ermöglichte es, den gesamten Histonkomplex zu deletieren und damit die erste definierte Histonnullmutation (HisC) in einem eukaryotischen Organismus herzustellen. HisC-mutante Embryonen, die über maternal eingelagerte Histon-mRNAs und Histonproteine verfügen, führen die ersten 14 embryonalen Zellzyklen aus. Danach sind die mutanten Zellen zwar noch in der Lage, die DNA-Replikation in der S-Phase 15 vollständig durchzuführen, arretieren dann aber im Zellzyklus. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Histonneusynthese und DNA-Replikationsrate gekoppelte Prozesse sind, und dass es einen bislang unbekannten Mechanismus gibt, der während oder nach der DNA-Replikation die Nukleosomenassemblierung überwacht und gegebenenfalls einen Zellzyklusarrest bewirkt, der von der Repression der Phosphatase String abhängig ist. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die HisC-Deletion durch transgene Histongene dosisabhängig komplementiert wird. Dieses Histondeletion/Transgen-System ermöglicht es, die Funktion von Histon-abhängigen Prozessen und die biologische Relevanz von Histonmodifikationen in einem multizellulären Organismus zu untersuchen und damit auch erstmalig die „Histoncode“-Hypothese kritisch zu testen.

Histones are target of post-translational chemical modifications that modulate chromatin structure and control genome function. It was not possible, however, to directly assess the in vivo function of histones in higher eukaryotes, since corresponding histone mutants were not available. The lack of such histone mutants, and in particular a histone null mutant, is due to the reiteration and wide genomic distribution of histone genes in most of the higher organisms. In order to establish an experimental system that allows testing designed histone mutants, I made use of the unique histone gene organization in Drosophila melanogaster, where all histone genes are clustered at a single chromosomal site in the ‘histone complex’. Here I report the generation and characterization of a deletion that uncovers the histone complex, representing a histone null mutation (termed ‘HisC’). In HisC mutant embryos, the maternally derived histones are sufficient to drive the first 14 embryonic cell cycles. In the absence of zygotic histone expression, embryos fail to complete cell cycle 15 and die. The mutant cells are able to duplicate their DNA at very low rate in S phase 15 but they fail to enter the subsequent mitosis and arrest instead. The results suggest that histone supply determines the rate of S phase progression to ensure a balance between DNA replication and nucleosome assembly. In addition, the data imply a novel surveillance mechanism that is able to stall the cell cycle by repressing the expression of the phosphatase String when proper nucleosome assembly fails. Moreover, both cellular and embryonic lethality phenotypes could be rescued in a gene dose-dependent manner by transgenes carrying histone genes. This novel histone deletion/transgene system provides a unique tool to explore histone-based processes and to test the significance of histone modifications in terms of the proposed ‘histone code’ in a multicellular organism.

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Günesdogan, Ufuk: Etablierung eines genetischen Systems zur Funktionsanalyse von Histonen und Histonvarianten von Drosophila melanogaster. 2010.

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