Molecular analysis of TTL-deficiency in pre- and postmitotic cells

Fischer, Andreas

Microtubules (MTs) are involved in a large variety of cellular functions. Both the polar structure and the highly dynamic behaviour as well as interaction partners and several posttranslational modifications influence microtubule properties. This study focuses on the tyrosination cycle, an a-tubulin-specific posttranslational modification. In order to uncover its physiological role, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking tubulin-tyrosine ligase (TTL) were characterized regarding different tubulin pools and MT plus-end tracking proteins (+TIPs). In the past, a mislocalisation of the +TIP CLIP-170 in TTL knockout neurons (Erck et al., 2005) as well as the inability of CAP-Gly domain-containing +TIPs to bind MT plus-ends in Tyr-negative MEFs have been reported (Peris et al., 2006). Here we clearly demonstrate that CAP-Gly domain-containing proteins localise at plus-ends of both tyrosinated and detyrosinated MTs. Interestingly, CLIP-115-decorated MT plus-end comets are elongated in Tyr-negative TTL-deficient MEFs. Furthermore, as compared to wild type MEFs, CLIP-115 appears in a less phosphorylated state in TTL knockout MEFs. Inhibition of different phosphatases indicated the involvement of a tyrosine residue. Subsequently, site-directed mutagenesis revealed an important role for tyrosine 270 in MT binding. Additionally, mass spectrometry analyses identified two CLIP-115 peptides that most probably contain a serine phosphorylation. One of these peptides covers a part of the second serine-rich region of CLIP-115, which is involved in MT plus-end tracking. Future experiments should, therefore, concentrate on the involvement of the contained serine residues in MT binding. Moreover, the identification of kinases or phosphatases that affect CLIP-115 in TTL knockout cells will ultimately reveal a new +TIP/MT binding mechanism.

Mikrotubuli (MT) sind in vielfältige zelluläre Funktionen involviert, was durch ihr hochdynamisches Verhalten, aber auch durch Interaktionspartner und verschiedene posttranslationale Modifikationen ermöglicht wird. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Detyrosinierung/Tyrosinierung der a-Tubulin-Untereinheiten. Um die physiologische Bedeutung des Tyrosinierungszyklus aufzudecken, wurden Mausembryo-Fibroblasten (MEFs) aus Tubulin-Tyrosin-Ligase (TTL)-Knockout-Mäusen bezüglich verschiedener Tubulin-Pools und Proteine mit spezifischer Bindung an MT-Plus-Enden (+TIPs) untersucht. Bisher wurden eine Misslokalisation des +TIP CLIP-170 in TTL-Knockout-Neuronen (Erck et al., 2005) sowie die Unfähigkeit von mit CAP-Gly-Domänen ausgestatteten +TIPs zur Bindung an Plus-Enden detyrosinierter MT berichtet (Peris et al., 2006). Hier zeigen wir deutlich, dass Proteine, die CAP-Gly-Domänen besitzen, an Plus-Enden tyrosinierter und detyrosinierter MT lokalisieren. Außerdem besitzen TTL-defiziente MEFs, die kein tyrosiniertes Tubulin enthalten, verlängerte CLIP-115-markierte Plus-Enden. Zusätzlich liegt CLIP-115 in TTL-Knockout-MEFs in einem geringer phosphorylierten Zustand als im Wildtyp vor. Die Inhibition verschiedener Phosphatasen wies auf die Beteiligung eines Tyrosins in der differenziellen Phosphorylierung von CLIP-115 hin. Gezielte Punktmutationen offenbarten daraufhin eine wichtige Rolle von Tyrosin 270 für die MT-Bindung. Darüber hinaus konnten wir durch Massenspektrometrie ein Peptid von CLIP-115 identifizieren, das höchstwahrscheinlich eine Serinphosphorylierung trägt. Dieses Peptid stammt aus der zweiten serinreichen Region, die in die Lokalisation an MT involviert ist. Zukünftige Experimente sollten daher den Einfluss enthaltener Serine auf die MT-Bindung untersuchen. Außerdem würde die Identifizierung beteiligter Kinasen oder Phosphatasen einen neuen Bindemechanismus von +TIPs an MT offenlegen.

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Fischer, Andreas: Molecular analysis of TTL-deficiency in pre- and postmitotic cells. 2010.

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