Knockdown surface expression of p75 neurotrophin receptor with ER retained intrabody in mammalian cells

Zhang, Congcong

Obwohl der Neurotrophinrezeptor p75 (p75NTR) als einer der ersten Neurotrophinrezeptoren isoliert wurde, ist seine physiologische Funktion und seine Beteiligung an Signaltransduktionswegen bis heute noch nicht vollständig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden intrazellulären Antikörper (intrabodies) eingesetzt, um einen phänotypischen knockdown des Oberflächenproteins p75NTR auf Säugerzellen zu erreichen. Bei dieser Technik, die auf posttranslationaler Ebene wirkt, wird die Sekretion des Zielantigens verhindert, indem man an einen spezifischen Antikörper ein ER-Retentionssignal anhängt. Dieses Retentionssignal ist für den Verbleib des Zielproteins im ER (Endoplasmatisches Retikulum) der Zelle verantwortlich. Mittels der Phage Display Technologie wurden verschiedene scFvs gegen p75NTR isoliert. Alle scFvs wiesen nanomolare Affinität gegenüber ihrem Antigen auf und wurden im weiteren Verlauf der Arbeit in ER-intrabodies umkloniert. Nach einer transienten Transfektion von p75NTR-positiven Zelllinien (PC12 und NSC19) mit dem intrabody SH325-G7-KDEL konnte mittels Durchflusszytometrie eine signifkante Herunter Regulation des p75NTR-Oberföächenproteins gezeigt werden. Dieser Effekt konnte über einen Zeitraum von acht Tagen aufrechterhalten werden, ohne dabei dem unfolded protein response (UPR), einen Stressindikator der Zelle, zu aktivieren. Weiterhin wurde der Effekt des intrabody SH325-G7-KDEL in murinen, primären Hippocampuszellen untersucht. Nach transienter Transfektion konnte mittels Sholl-Analyse gezeigt werden, dass eine reduzierte p75NTR-Oberflächenexpression zu einer signifikant erhöhten Komplexität der Neuronen führte. Zusammenfassend wurde mit den in dieser Arbeit isolierten funktionellen ER-intrabodies ein weiteres Beispiel dafür gegeben, dass der posttranslationale Knockdown von Proteinen eine viel versprechende Methode ist, um die molekularen Mechanismen von Oberflächenproteinen zu untersuchen.

Although p75 neurotrophin receptor (p75NTR) is the first neurotrophin receptor isolated, its precise functions in physiology and underlying signaling have remained elusive for many years. In this study, endoplasmic reticulum retained intrabody (ER-intrabody) technology was applied to knockdown p75NTR surface expression in mammalian cells. By fusing with the C-terminal ER retention signal KDEL, ER-intrabody impedes target receptor protein from secretory trafficking. Monoclonal recombinant scFvs against p75NTR were isolated by phage display. These scFvs bound to p75NTR with nanomolar affinities and were used to generate p75NTR-specific ER-intrabodies. In neuron-like cell lines PC12 and NSC19, p75NTR surface expression was significantly suppressed by the p75NTR-specific ER-intrabody construct SH325-G7-KDEL. The effect of this ER-intrabody on p75NTR surface knockdown could be maintained over a period of more than eight days without obviously activating unfolded protein response (UPR). Finally, the downregulation of p75NTR surface expression was determined in mouse hippocampal primary cultures using the ER-intrabody SH325-G7-KDEL. Sholl analysis showed that dendritic complexity of neurons was significantly increased if the p75NTR expressions were reduced on their surfaces by the ER-intrabody. In conclusion, the novel ER-intrabody SH325-G7-KDEL inhibits the surface translocation of p75NTR and ER-intrabody knockdown technology may become a powerful tool to investigate molecular mechanisms of target neuronal receptors.

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Zhang, Congcong: Knockdown surface expression of p75 neurotrophin receptor with ER retained intrabody in mammalian cells. 2010.

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