Entwicklung eines Expressionssystems für rekombinante Antikörper in mammalischen Zellen

Hoch, Alexandra Selma Helene

Zur ökonomischen biopharmazeutischen Produktion liegt ein Focus auf der Entwicklung von Produktionszelllinien mit hohen, vorhersagbaren und stabilen Produktivitäten. Viele Unternehmen nutzen hierzu Säugerzellen, da diese zusätzlich den regulatorischen Anforderungen entsprechen. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer CHO-DG44-Zelllinie zur rekombinanten Antikörperproduktion unter Verwendung eines Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch-Systems (RMCE). Dieses System sollte zur Etablierung einer isogenen Basiszelllinie genutzt werden, von der ausgehend verschiedene Antikörper mit vorhersagbaren Produktivitäten exprimiert werden können. Um mit dem Selektionsprozess eine möglichst zielorientierte Analyse zu gewährleisten, wurde ein sezernierbares Fusionsprotein entwickelt, welches eine murine schwere IgG1-Antikörperkette imitiert, bei dem die variable Region durch das grün fluoreszierende Protein EGFP ersetzt wurde. Es konnte gezeigt werden, dass dieses sowohl intrazellulär mittels Durchflusszytometrie als auch extrazellulär im ELISA detektierbar war. Für stabil transfizierte Zellen unbekannter Gen-Kopienzahl wurden RMCE-Experimente durchgeführt, in denen das Fusionsgen durch humanisierte IgG1-Antikörperketten ersetzt wurde. In der phänotypischen Analyse konnten wenige RMCE-positive Klone identifiziert und anschließend auf genomischer Ebene verifiziert werden. Auffällig war der Mehrkopienstatus dieser Klone, der eine Erklärung für die geringe Effizienz des RMCE-Systems liefert. Die spezifischen Produktionsraten der so generierten hum.IgG1-Produzenten betrugen maximal 1,5 pcd. Im Rahmen der Arbeit wurde zudem das „Antibody CHO Capture System“ zur Anreicherung von Hochproduzenten etabliert. Eine Machbarkeit konnte für das System gezeigt, aber in Hinblick auf die hier generierten hum.IgG-Produzenten vermutlich aufgrund der niedrigen Produktivitäten nicht bestätigt werden. Durch Optimierung ist es denkbar, Hochproduzenten mit einer guten Sekretions-Kapazität anzureichern.

Biopharmaceutical companies focus on developing production cell lines permitting high, predictable and stable specific productivities. Most companies use mammalian cells, as they comply with most regulatory demands. The aim of this work was the development of a CHO-DG44 cell line for recombinant antibody production using a Recombinase-Mediated Cassette Exchange system (RMCE). This system should be used for the establishment of an isogenic basic cell line that could be used for expression of different antibodies with predictable productivities. To provide for a selection process permitting a target-oriented analytical method a fusion protein was developed mimicking a murine heavy IgG1 antibody chain with the variable region replaced by the gene for the enhanced green fluorescent protein EGFP. It was intracellularly detectable via flow cytometry, and extracellularly via ELISA. Stably transfected cells with unknown gene copy numbers were subjected to RMCE resulting in the replacement of the fusion gene by humanized IgG1 antibody genes. Applying a phenotypical analysis, few RMCE positive clones could be identified which were further verified by genomic analyses. Noticeable was the multi-copy status of these clones explaining the low frequency of the occurred cassette-exchange. The specific productivities of the RMCE-generated hum.IgG1 producer clones were determined with a maximum of 1.5 pcd. In the context of this work, the „Antibody CHO Capture System“ for the enrichment of producer cells was established. The feasibility could be shown for this system, but it could not be approved using the generated hum.IgG1 producer clones, presumably due to the existing low productivities of the cells. It is conceivable to select for high producer clones with a high capacity of protein secretion by further optimization.

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Hoch, Alexandra Selma Helene: Entwicklung eines Expressionssystems für rekombinante Antikörper in mammalischen Zellen. 2010.

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