cDNA Klonierung einer Prenyltransferase aus der Arzneipflanze Hypericum perforatum

Kühle, Susanne

Das Johanniskraut (Hypericum perforatum L.) ist eine alte Heilpflanze, deren Extrakte in der antidepressiven Therapie zum Einsatz kommen. Der Hauptinhaltsstoff ist das polyprenylierte bizyklische Acylphloroglucinol-Derivat Hyperforin. Es weist neben der antidepressiven Wirksamkeit weitere pharmakologische Qualitäten auf. Vor allem die Induktion von Apoptose bei verschiedenen Tumorzelllinien besitzt vielversprechendes Potenzial. Die Biosynthese des Hyperforins ist nur in Ansätzen aufgeklärt. Das Grundgerüst Phlorisobutyrophenon wird durch Kondensation von 3 Malonyl-CoA mit dem Startersubstrat Isobutyryl-CoA gebildet. Durch anschließende vierfache Prenylierung und Zyklisierung wird Hyperforin aufgebaut. Die den ersten Prenylierungsschritt katalysierende Prenyltransferase konnte bereits in Zellkulturen von Hypericum calycinum als ein lösliches Enzym charakterisiert werden. Diese Enzymaktivität wurde ebenfalls in Hypericum perforatum Sprosskulturen nachgewiesen. Ein 400 bp langes Mittelstück mit hoher Ähnlichkeit zu bekannten aromatischen Prenyltransferasen wurde durch Homologie-Klonierung gefunden. Die organspezifische Expression legt nahe, dass es sich um eine Prenyltransferase der Hyperforin-Biosynthese handelt. Mittels der RACE-Technik konnte dieses Mittelstück zum 3‘-Ende vervollständigt werden. Unter Verwendung diverser Modifikationen der 5‘ RACE gelang es die Sequenz schrittweise um 250 bp zu verlängern. Der Einsatz verschiedener Techniken, z.B. SiteFinding PCR und Semi-Nested PCR mit einem degenerierten TATA-BOX-Primer unter Verwendung genomischer DNA, blieb jedoch ohne Erfolg. Der vollständige offene Leserahmen konnte nicht erhalten werden. In der vorhandenen Sequenz wurden sechs potenzielle Transmembrandomänen berechnet, so dass es sich wahrscheinlich nicht um die erste, lösliche Prenyltransferase der Hyperforin-Biosynthese handelt.

St. John’s wort (Hypericum perforatum L.) is an ancient medicinal herb, a number of remedies are used in antidepressant therapy. Its major constituent is the polyprenylated bicyclic phloroglucinol derivative hyperforin. Besides antidepressant activity, it possesses various pharmacological qualities. In particular, the induction of apoptosis in a series of tumour cell lines provides promising potential. The biosynthesis of hyperforin is far from being understood. The basic scaffold phlorisobutyrophenone is formed by condensation of three units of malonyl-CoA with the starter substrate isobutyryl-CoA. Hyperforin is formed by subsequent fourfold prenylation and cyclization. In cell cultures of Hypericum calycinum, the enzyme catalyzing the first prenylation step has been characterized as a soluble protein. This enzyme activity was also detected in Hypericum perforatum shoot cultures. A 400 bp core fragment showing high similarity to known aromatic prenyltransferases in the databank was found by homology cloning. The organ-specific expression suggests that it codes for a prenyltransferase involved in hyperforin biosynthesis. The central fragment was extended to the 3 'end using common RACE techniques. Various modifications of 5 'RACE gradually led to a 250 bp sequence extension towards the 5’end. However, the use of different techniques, such as SiteFinding PCR and semi-nested PCR with a degenerate TATA-BOX-primer using genomic DNA, failed. The complete open reading frame (ORF) could not be obtained. In the so far existing sequence, six potential transmembrane domains were found, suggesting that the cDNA does probably not encode the first, soluble prenyltransferase of hyperforin biosynthesis.

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Kühle, Susanne: cDNA Klonierung einer Prenyltransferase aus der Arzneipflanze Hypericum perforatum. 2009.

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