The functional role(s) of diaphanous related formins in protrusion

Block, Jennifer

Filopodien sind protrusive Strukturen, die aus Bündeln von unverzweigten Aktinfilamenten bestehen. Um die funktionelle Rolle des Diaphanous verwandten Formins Drf3 in der Filopodienbildung genauer zu charakterisieren wurde durch Deletion der DAD-Domäne ein konstitutiv aktives Drf3 (Drf3ΔDAD) hergestellt. Expression von Drf3ΔDAD in B16-F1 Mausmelanomzellen induzierte die Bildung von Filopodien, an deren Spitze das Formin angereichert war. In einigen Fällen konnte beobachtet werden, dass sich Drf3ΔDAD induzierte Filopodien verdickten, nachdem sie das umgebende Aktinnetzwerk verlassen hatten. Elektronenmikroskopische Untersuchungen ergaben, dass dieses auf eine erhöhte Anzahl an Aktinfilamenten in der Spitze der Filopodien zurückzuführen war, wobei die Packdichte konstant blieb. Außerdem bestand eine lineare Korrelation von F-Aktin zu Drf3ΔDAD. Zusammengenommen zeigt dieses, dass das Verdicken der Filopodien durch de novo Nukleation von Aktinfilamenten zu erklären ist. Zusätzlich zu Drf3 ist das Formin FMNL2 ein potentieller Kandidat, der zur Bildung von Filopodien aber auch Lamellipodien betragen könnte. In B16-F1 Zellen lokalisiert ein aktives EGFP-getaggtes FMNL2 an der Spitze von Filopodien und Lamellipodien. In Vitro interagiert FMNL2 mit aktivem Cdc42 und aktivem Rac1, aber nur die Koexpression von aktivem Cdc42 ist ausreichend, um die Anreicherung des Formins im Lamellipodium zu vermitteln. Des Weiteren trägt eine N-terminale Myristoylierung zur Regulation von FMNL2 bei. Obwohl diese Lipidmodifikation weder für die Lokalisation im Lamellipodium noch für die Interaktion mit Cdc42 essentiell ist, tragen die Myristoylierung und Cdc42 vermutlich durch Aufheben der Autoinhibition zur Lokalisation von FMNL2 bei. In Vitro Aktinpolymerisationsassays zeigten, dass FMNL2 nicht als Aktinnukleator fungiert, sondern im Zusammenspiel mit Profilin die Elongation von bestehenden Aktinfilamenten unterstützt. In Vivo kontrolliert FMNL2 die effiziente Zellmigration.

To characterize the role of mDia2/Drf3 in mammalian cells, an EGFP-tagged active Drf3 variant, lacking the C-terminal DAD-domain (Drf3ΔDAD), was generated. Expression of EGFP-Drf3ΔDAD in B16-F1 mouse melanoma cells strongly induced the formation of filopodia tipped by the formin. Interestingly, Drf3ΔDAD–containing filopodia frequently thickened at their tips after protruding beyond the cell periphery. Yet, actin filament spacing in these filopodia was largely independent of filopodial width, as determined by electron microscopy. In addition to that, Drf3ΔDAD levels and F-actin amounts showed a linear correlation in these filopodia tips. Thus, thickening of Drf3ΔDAD-induced filopodia tips occurs through de novo actin filament nucleation. This indicates nucleation of actin filaments to be the predominant mechanism of actin filament generation in filopodia, rather than simple elongation of pre-existing lamellipodial filaments. FMNL2 emerged as potential additional regulator of filopodia, but also lamellipodia formation. Active EGFP-tagged FMNL2 was strongly enriched at the tips of protruding lamellipodia and filopodia in B16-F1 cells. FMNL2 interacted with active Cdc42 and Rac1 in vitro. Interestingly, co-expression of Cdc42, but not Rac, was sufficient to mediate accumulation of EGFP-tagged FMNL2 at the tips of lamellipodia and filopodia. In addition, FMNL2 appeared to be regulated by N-terminal myristoylation. Although myristoylation was not essential for interaction of the formin with Cdc42 and proper subcellular targeting, both the lipid modification and active Cdc42 contribute to localisation and activation by counteracting autoinhibition. In vitro polymerisation assays indicated that FMNL2 does not promote actin filament nucleation, but instead elongation powered by profilin. In vivo the presence of FMNL2 was relevant for efficient cell motility, significantly expanding the repertoire of Cdc42 effectors directly promoting actin filament assembly in migration.

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Block, Jennifer: The functional role(s) of diaphanous related formins in protrusion. 2010.

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