Analysis of infectious diseases in conditional mouse mutants

Pisano, Fabio

Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil wird die Generierung einer konditionalen IL-12p40 Mausmutante beschrieben. Für diesen Zweck wurde die Methodik des ET Klonierens genutzt, um den endogenen Lokus des murinen IL-12p40 Gens zu modifizieren. Das daraus resultierende Targeting Konstrukt wurde in murine ES Zellen eingebracht, um die konditionale Mutation im Il-12p40 Gen mittels Gen Targeting in vitro zu etablieren. Die daraus resultierenden homolog rekombinierten ES Zelklone wurden anschließend in murine Blastozysten injiziert, um eine konditionale Mausmutantenlinie zu generieren. Bis zum Abschluss dieser Dissertation konnte bei keiner der chimären Nachkommen eine Besiedelung der Keimbahn nachgewiesen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch gezielte Verpaarung von MnSODfl/fl Mäusen mit LysM-Cre Mäusen eine Deletion von MnSOD in Makrophagen bzw. Neutrophilen erzielt. Hierbei konnte als erstes die spezifische und effiziente Deletion von MnSOD in Makrophagen bzw. Neutrophilen mittels Southern Blot nachgewiesen werden. Diese konditionalen Mausmutanten wurden schließlich in drei verschiedenen Infektionsmodellen getestet, um eine mögliche Rolle von MnSOD während bakterieller Infektionen zu untersuchen. Als Infektionsorganismen wurden Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus sowie Listeria monocytogenes ausgewählt. Es konnte gezeigt werden, dass die Deletion von MnSOD keine Auswirkungen auf den Infektionsverlauf mit dem Erreger Staphylococcus aureus in der Maus zu haben scheint. Jedoch zeigte sich im Infektionsmodell mit dem Pathogen Listeria monocytogenes eine protektive Rolle für MnSOD. Die spezifische Deletion von MnSOD in Makrophagen bzw. Neutrophilen führt zu einer signifikant höheren Suszeptibilität der konditionalen Mausmutanten gegenüber Listeria monocytogenes, was sich in einer geringeren Überlebensrate der Tiere sowie einer höheren Anzahl von Listerien in den Organen widerspiegelt.

This thesis comprises two parts. The first part concerns the generation of an IL-12p40 conditional knock-out mouse. ET cloning was employed to modify the endogenous locus of the IL-12p40 murine gene contained in a BAC vector. The resulting targeting construct was capable of recombining homologously within ES cells, which were subsequently injected into blastocysts in order to generate a conditional knock-out mouse line. None of the generated chimeras could be tested for germ-line transmission due to early lethality and sterility. In part two, macrophage and/or neutrophil specific MnSOD knock-out mice were obtained through the breeding of MnSODfl/fl to LysM-Cre mice. Initially, the LysMCre-driven deletion of the loxP-flanked exon3 of MnSOD was shown to be specific and efficient. Subsequently, three different infection models, namely Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes, were tested in order to investigate the role of MnSOD during both extra-cellular and intra-cellular bacterial infections. The MnSODfl/fl x LysMCre breeding was not on a pure C57BL/6 genetic background. Thus, the results concerning the streptococcal infection model are not interpretable at this point. MnSOD deficiency was found to be irrelevant for the outcome of the infection during Staphylococcus aureus intravenous infections. However, a major protective role of MnSOD in Listeriosis models was established. Macrophage and/or neutrophil specific MnSOD knock-out mice displayed a significantly higher susceptibility to intravenous Listeria monocytogenes infection compared to controls, as implied by a lower survival rate and higher bacterial burden in liver and spleen. Moreover, in-vitro experiments showed a higher bacterial up-take and a lower efficiency in killing bacteria.

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Pisano, Fabio: Analysis of infectious diseases in conditional mouse mutants. 2009.

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