Development of novel drug screening assays and molecular characterization of rifampicin and pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis

Bhuju, Sabin

Es gibt einen dringenden Bedarf für ein besseres Verständnis der Mechanismen, die zu Antibiotikaresistenzen bei M. tuberculosis führen. Darüberhinaus ist die Entwicklung schneller Verfahren notwendig, die ein High-throughput screening für die Entwicklung neuer Wirkstoffe möglich machen, die nicht nur gegen arzneimittelresistente Tuberkulose (TB), sondern auch für die Behandlung persistenter und latenter Tuberkuloseinfektionen verwendbar sind. Rifampicin ist eines der stärksten und wirkungsvollsten Medikamente gegen TB. Dennoch wird eine Resistenz gegen Rifampicin bei M. tuberculosis durch eine Mutation im rpoB Gen, einer Untereinheit der RNA-Polymerase (RNAP), verursacht. Der Enzymkomplex als Ganzes ist ein weithin bekanntes Ziel für neue Wirkstoffentwicklungen, daher wurde in der (vorliegenden) Arbeit ein RNAP assay für das Drug screening (erfolgreich) realisiert . Die hierzu etablierteMethode, ist für den Hochdurchsatz geeignet ,kosteneffektiv und verwendet natürliche Nukleotide. Mittels dieses Tests wurden einige Wirkstoffkanditaten geprüft. Pyrazinamide (PZA) ist eine Nikotinamid ähnlich Substanz, die auch als Frontliniedroge verwendet wird, um TB zu behandeln. Der genaue Wirkmechanismus von PZA, eines der wichtigsten antimykobakteriellen Medikamente, ist jedoch noch nicht geklärt. Für eine Resistenz gegen PZA sind meistens Veränderungen im pncA Gen von M. tuberculosis verantwortlich. Um zum weiteren Verständnis der molekularen Grundlagen der PZA-Resistenzs in M. tuberculosis beizutragen, wurden pncA DNS Sequenzen von PZA-resistenten und -resistenzanfälligen klinischen Isolaten von M. tuberculosis analysiert. Die Analyse identifizierte einige bis jetzt nicht berichtete Veränderungen. Weiterhin wurde das pncA Gen von M. tuberculosis H37Rv in Escherichia coli BL21 (DE3) kloniert, gereinigt und charakterisiert. Es konnte ein Hochdurchsatz–Pyrazinamidase-Test in 96-Well-Platten entwickelt werden, der für die Erforschung neuer Therapien bei TB weiter genutzt werden kann.

There is an urgent need for a better understanding of the mechanisms of resistance to antibiotics in M. tuberculosis and for the development of rapid assays suitable for high-throughput screening for the development of new drugs not only against drug resistant tuberculosis (TB) but also for the treatment of persistent and latent tuberculosis infection. Rifampicin is one of the most potent and most effective drug against TB. However resistance to rifampicin in M. tuberculosis strain is caused due to mutation in rpoB gene, a subunit of RNA polymerase (RNAP). The enzyme complex as a whole is a well known target for new drug development. RNAP assay for the screening of drug was devised in the work. The method established was cost effective, suitable for high-throughput use and utilized natural nucleotides. With the devised assay several drug candidates were tested. Pyrazinamide (PZA) is a nicotinamide analog which is also used as a frontline drug to treat TB. The exact mechanism of action of PZA, one of the most important antimycobacterial drug is still elusive. Mutations in pncA gene of M. tuberculosis are mostly responsible for the resistance developed by M. tuberculosis against PZA. In other to further understand the molecular basis of PZA resistance in M. tuberculosis, DNA sequence of pncA from PZA resistant and susceptible clinical isolates of M. tuberculosis were analysed. The analysis identified several different as yet unreported mutations. Further the pncA gene of M. tuberculosis H37Rv was cloned in E. coli BL21 (DE3), purified and characterized. A high throughput pyrazinamidase assay was developed in 96 well plate, which can be further used for the exploration of novel therapy for TB.

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Bhuju, Sabin: Development of novel drug screening assays and molecular characterization of rifampicin and pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis. 2008.

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