Signalmoleküle in der Regulation des Aktinzytoskeletts: Die Rolle von Nck in WAVE-vermittelten Prozessen

Städing, Kai

Die Regulation des Aktinzytoskeletts unterliegt einer Vielzahl von Faktoren, von denen ein großer Teil noch nicht abschließend geklärt ist. Die maßgebliche Rolle, die das Aktinfilamentsystem für die Motilität von Zellen während der Embryogenese, im Immunsystem oder auch bei der Metastasierung von Krebszellen spielt, macht eine möglichst genaue Aufklärung der beteiligten Vorgänge erforderlich. Die Einflüsse zahlreicher Signal- und Adapterproteine auf das Zytoskelett sind teilweise bekannt, ihre Signalwege aber letztlich noch nicht verstanden. Die Proteine der Nck-Familie stellen eine Klasse solcher Adapter dar. Die SH3-Domänen der Ncks binden zahlreiche Proteine mit Prolin-reichen Sequenzen wie z.B. Proteinen des WAVE-Komplex. WAVE als Teil der WASP/WAVE-Proteinfamilie spielt eine entscheidende Rolle für die Arp2/3-vermittelte Aktinreorganisation. Die SH2-Domäne von Nck bindet an phosphorylierte Tyrosine wie z.B. in Wachstumsfaktorrezeptoren. In der vorliegenden Arbeit werden die Nck/WAVE-Komplex-Interaktion und eine Verbindung zu weiteren Nck-Interaktionspartnern genauer untersucht. In Immunpräzipitationen und GST-Pulldownexperimenten zeigt sich, dass nur die erste SH3-Domäne von Nck für die Bindung mit dem WAVE-Komplex verantwortlich ist. Auf neuartigen Peptid-Micro-Arrays wurden die bevorzugten Bindungssequenzen einer ganzen Reihe von SH3-Domänen aus Zytoskelett-relevanten Adaptoren untersucht. Das Bindungsmotiv der ersten SH3-Domäne in den WAVE-Komplex-Proteinen wurde als eine Reihe von 5 Prolinen, flankiert von Tryptophan und einer sauren Aminosäure, charakterisiert. In Immunpräzipitationen aus verhungerten und mit Phorbolester stimulierten Zellen konnte eine Abhängigkeit der Nck/WAVE-Komplex-Interaktion vom Phosphorylierungsstatus des Komplexes beobachtet werden. Nck bindet dabei bevorzugt an den nicht phosphorylierten WAVE-Komplex. Nck-knockout-Zellen wurden mit Nck und SH3-Domänenmutanten von Nck transfiziert. Zellen, die Nck ohne intakte erste SH3-Domäne exprimieren, zeigen deutliche Defekte in der zellulären Antwort auf Wachstumsfaktorstimulation. Die zweite SH3-Domäne ist hierbei ebenfalls beteiligt, wenn auch weniger stark als die erste. Als Ergebnis der Arbeit wird eine mögliche Rolle von Nck als Adapterprotein in der Aktivierung und eventuell auch in der Lokalisation des WAVE-Komplexes aufgezeigt.

The regulation of the actin cytoskeleton is subject to a multitude of factors of which a large proportion is not yet completely clarified. The microfilament system takes a crucial role in the motility of cells during embryogenesis, in immune defense and in cancer metastasis. Therefore, unraveling the details of the involved processes is of major importance. There is a great number of signaling and adaptor proteins with known effect on the cytoskeleton, but the signaling pathways in which these proteins are participating are not properly understood. The proteins of the Nck-family are such a class of adaptors. The SH3-domains of the Ncks specifically bind several proteins with Proline-rich sequences. For example an interaction of Nck and the WAVE-complex is known. WAVE is a member of the WASP/WAVE-protein family which plays a major role in Arp2/3-mediated action reorganization. The SH2-domain binds to phosphorylated Tyrosines e.g. in growth-factor receptors. In this thesis the interaction of Nck with the WAVE-complex and possible links to other Nck-interactors have been studied. In immunoprecipitations and GST-pulldown experiments only the first SH3-domain of Nck binds to the WAVE-complex. Novel peptide micro-arrays were used to characterize the binding motifs of several SH3-domains in cytoskeleton-related adaptors. The binding site of the first SH3-domain of Nck in the WAVE-complex proteins WAVE and Abi is a series of 5 Prolines flanked by a Tryptophan and an acidic residue. Immunoprecipitations of serum-starved cells and cells stimulated with phorbolic ester have shown a link between Nck/WAVE-complex interaction and phosphorylation status of the WAVE-complex. Nck binds preferably to non-phosphorylated WAVE-complex. Nck-k.o.-cells have been transfected with Nck and SH3-mutants of Nck. Cells expressing Nck with a deficient first SH3-domain have shown significantly reduced dorsal ruffling in response to platelet-derived growth factor stimulation. Moreover a deficient second SH3-domain has visible effects on PDGF response, but less prominent than a mutated first SH3-domain. The results presented here are suggesting a role of Nck as adaptor protein involved in activation and possibly in localization of the WAVE-complex.

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Städing, Kai: Signalmoleküle in der Regulation des Aktinzytoskeletts: Die Rolle von Nck in WAVE-vermittelten Prozessen. 2009.

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