Hyperforin-Biosynthese: cDNA Klonierung der Isobutyrophenon-Synthase aus Hypericum perforatum und H. calycinum

Meva Meva, William

Zubereitungen aus Hypericum perforatum L. werden zur Behandlung leichter bis mittelschwerer Depressionen eingesetzt. An ihrer Wirkung ist das Phoroglucin-Derivat Hyperforin als Wiederaufnahme-Hemmer von Neurotransmittern beteiligt. Das Grundgerüst des Hyperforins wird von einer Typ III Polyketid-Synthase (PKS III), der Isobutyrophenon-Synthase (BUS) gebildet, die Isobutyryl-CoA als Startersubstrat mit drei Molekülen Malonyl-CoA kondensiert. Weitere Vertreter der PKS III-Enzymfamilie sind Chalkon-Synthase (CHS) und Benzophenon-Synthase (BPS), die 4-Cumaroyl-CoA bzw. Benzoyl-CoA als Startermoleküle mit Malonyl-CoA zu Naringenin-Chalkon (Flavonoid-Biosynthese) bzw. Phlorbenzophenon (Xanthon-Biosynthese) umsetzen. cDNAs für CHS und BPS wurden aus H. perforatum und H. calycinum in unserer Arbeitsgruppe bereits kloniert und charakterisiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die cDNA-Klonierung und funktionelle Expression der BUS. Aus Adhyperforin-produzierenden Zellkulturen von H. calycinum sowie aus intakten Pflanzen von H. calycinum und H. perforatum wurde poly(A+)-RNA isoliert und in cDNA revers transkribiert. Für die Amplifikation von PKS III-Fragmenten wurden degenerierte Primer entworfen, die sich von konservierten Regionen bekannter PKS III-Sequenzen ableiten. Durch PCR wurden drei cDNA-Fragmente gewonnen, die 79 - 85% Identität mit PKS III in der Datenbank aufweisen. Mittels 3´-RACE PCR wurden die Klone stromabwärts vervollständigt. Die anschließende 5´-RACE PCR konnte bislang ein cDNA-Fragment in einen Volllänge-Klon überführen. Zur Zeit wird durch Expression in E. coli geprüft, ob der ORF für BUS kodiert.

Pharmaceutical preparations of Hypericum perforatum (St. John´s Wort) are used for the treatment of mild to moderate depression. This antidepressant efficacy is mainly due to hyperforin. The biosynthesis of this polyprenylated acylphloroglucinol derivative starts with the condensation of isobutyryl-CoA with three molecules of malonyl-CoA, catalysed by isobutyrophenone synthase (BUS), a type III polyketide synthase (PKS). The resulting linear intermediate undergoes intramolecular Claisen condensation to yield phlorisobutyrophenone, the hyperforin skeleton. Other members of the PKS III family are chalcone synthase (CHS) and benzophenone synthase (BPS) which catalyse the formation of naringenin chalcone (flavonoid biosynthesis) and phlorbenzophenone (xanthone biosynthesis), respectively. Their starter substrates are 4-coumaroyl-CoA (CHS) and benzoyl-CoA (BPS). cDNAs encoding BPS and CHS from Hypericum species were previously cloned in our laboratory. The aim of the present work was cDNA cloning of BUS. H. perforatum plants and adhyperforin-producing H. calycinum cell cultures served for the isolation and reverse transcription of poly (A+) mRNA pools. Degenerate primers were designed that match conserved motives of known PKS III sequences. PCR with combinations of these primers led to the amplification of three new cDNA fragments that showed 79 - 85% identity to known PKS III sequences. 3´ and 5´ RACE PCR resulted in the amplification of one full-length clone that might be a promising candidate to encode BUS. Heterologous expression of this open-reading frame in E. coli for functional analysis is in progress.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Meva Meva, William: Hyperforin-Biosynthese: cDNA Klonierung der Isobutyrophenon-Synthase aus Hypericum perforatum und H. calycinum. 2009.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export