Structural and Biochemical Investigation of the Escherichia coli Oxygen Independent Coproporphyrinogen III Oxidase (HemN) and its Substrate

Rand, Katrin

Heme biosynthesis is one of the most essential biosynthetic pathways in nature. Under anaerobic conditions crucial steps like that of the oxygen independent coproporphyrinogen III oxidase (HemN), a member of the Radical SAM enzymes, have to proceed in the absence of molecular oxygen. It catalyzes the oxidative decarboxylation of coproporphyrinogen III to yield in protoporphyrinogen IX. In addition to the characteristic Radical SAM features, a second SAM molecule was identified in the structure which could potentially participate in HemN catalysis. Substantial progress in understanding the HemN reaction mechanism is expected by detailed knowledge of the substrate binding mode. Due to the oxygen sensitivity of HemN and coproporphyrinogen III an anaerobic working station was successfully set up in our laboratory as a precondition for experimental studies on this enzyme and protocols for HemN purification and crystallization were established. Three different methods have been applied to obtain coproporphyrinogen III. In this study large amounts of catalytically active protein were yielded through successful reconstitution of the oxygen sensitive HemN [4Fe-4S]-cluster. The established protocols were the basis for numerous co-crystallization experiments that have been set up. Intensive crystallographic studies were performed with wildtype protein and with HemN variants supposed to be involved in SAM2 binding. Different substrates in combination with an artificial electron donor or acceptor were utilized for crystallization. Despite numerous data sets that have been collected, neither for the wildtype nor for any mutant protein a crystal structure could be obtained with an unambiguously defined substrate bound. One major obstacle for a successful complex structure solution was found to be the dominant HemN crystal packing, which may impair the domain movement postulated to occur upon substrate binding. HemN was therefore forced to crystallize in a new space group by rational mutation of a single residue involved in crystal contacts. Although a different crystal packing could be obtained this way, the postulated domain movement is unlikely to occur in the new crystal packing arrangement. The results obtained in this work identified harderoporphyrinogen as a likely HemN reaction intermediate.

Die Hämbiosynthese ist einer der elementarsten Biosynthesewege der Natur. Unter anaeroben Bedingungen müssen dabei wichtige Reaktionen, wie die der sauerstoffunabhängigen Coproporphyrinogen III Oxidase (HemN), die Mitglied der Radical SAM Enzyme ist, ohne Sauerstoff stattfinden. HemN katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Coproporphyrinogen III zu Protoporphyrinogen IX. In der Kristallstruktur von HemN wurde zusätzlich zu den charakteristischen Radical SAM Merkmalen ein weiteres möglicherweise an der Katalyse beteiligtes SAM-Molekül gefunden. Entscheidende Fortschritte im Verständnis der HemN-Wirkungsweise werden durch detaillierte Kenntnisse über die Substratbindung erwartet. Da sowohl HemN als auch Coproporphyrinogen III sehr empfindlich gegenüber Sauerstoff sind, wurde eine anaerobe Arbeitsstation in unseren Laboren eingerichtet, um Experimente in einer sauerstofffreien Umgebung zu ermöglichen und Protokolle zur Reinigung und Kristallisation von HemN sowie zur Synthese des Substrates wurden dabei etabliert. Coproporphyrinogen III wurde über drei verschiedene Wege erhalten. Es ist gelungen, das sauerstoffempfindliche [4Fe-4S]-Cluster von HemN zu rekonstituieren und so große Mengen an katalytisch aktivem Protein zu erhalten. Zahlreiche Co Kristallisationsexperimente sowohl mit HemN Wildtyp als auch mit einer an der SAM2-Bindung beteiligten Variante wurden durchgeführt. Während der HemN Kristallisation wurden verschiedene Substrate kombiniert mit künstlichem Elektronendonor oder -Akzeptor eingesetzt. Obwohl zahlreiche Datensätze aufgenommen wurden, konnte weder für HemN Wildtyp noch für die HemN-Varianten eine Kristallstruktur ermittelt werden, in der ein Substratmolekül eindeutig definiert war. Es wurde gesehen, daß HemN vorwiegend in einer Kristallform kristallisiert, die offensichtlich das für HemN postulierte Umklappen der C-terminalen Domäne verhindert und dadurch eine Komplexstruktur verhindert. Daher wurde HemN durch den gezielten Austausch einer einzelnen Aminosäure, die an Wildtyp-Kristallkontakten beteiligt ist, in eine neue Kristallform gezwungen, die die Domänenbewegung aber auch nicht zulässt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass Harderoporphyrinogen das wahrscheinliche Zwischenprodukt der HemN-Reaktion ist.

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Rand, Katrin: Structural and Biochemical Investigation of the Escherichia coli Oxygen Independent Coproporphyrinogen III Oxidase (HemN) and its Substrate. 2009.

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