Der Einfluss von Raver1 auf „polypyrimidine tract-binding protein“- vermittelte Spleißprozesse

Swiniarski, Sascha

Auf Grund der Primärsequenz von drei RNA-Bindungsmotiven (RRMs) wurde das Protein Raver1 der Familie der hnRNPs zugeordnet, obwohl für Raver1 bisher keine direkte Interaktion mit RNA-Molekülen nachgewiesen werden konnte. Über Assoziation mit dem spezifischen Spleißfaktor PTB könnte Raver1 jedoch in die Prozessierung von RNA eingebunden sein und hier als Co-Repressor von PTB wirken, in dem Raver1 die repressive Wirkung von PTB auf alternativ inkorporierte Exons verstärkt. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch biochemische Analysen erstmals nachgewiesen, dass die RRMs von Raver1 prinzipiell in der Lage sind, an RNA zu binden. Weshalb das Gesamtprotein dennoch keine Wechselwirkung mit RNA in vitro zeigt, bleibt weiterhin zu klären. Die RNA-Interaktion von Raver1 erfolgt indirekt über den Raver-Liganden PTB, und es konnte die Bildung entsprechender trimerer Komplexe in vitro für Raver1 gezeigt werden. Für die direkte Bindung an PTB ist im Raver1 Protein im Wesentlichen ein einzelnes Bindungsmotiv mit der Aminosäuresequenz SLLGxxP entscheidend. Mutationen in diesem Motiv beeinträchtigen die PTB-vermittelte Rekrutierung des Raver1 Proteins in so genannte „perinucleolar compartments“ negativ. Durch vergleichende Analysen von Spleißmustern verschiedener PTB-Zielgene in Raver1-defizienten Mäusen und Wildtyp-Tieren wurde erstmals gezeigt, dass eine Modulation der Raver1-Expression auch in vivo einen Einfluss auf PTB-vermittelte Spleißprozesse hat. Untersuchungen an sechs PTB-Zielgenen mittels quantitativer „real-time“-PCR zeigten tatsächlich Verschiebungen in den Verhältnissen der alternativen Isoformen der Gene α Tropomyosin, c-src und FGF-Rezeptor2, die durch weiterführende Untersuchungen an den humanen Zelllinien HeLa und HEK bestätigt wurden. Diese Daten implizieren eine Beteiligung von Raver1 an alternativen Spleißprozessen, wobei der Verlust des Raver1-Proteins jedoch nicht eine universell co-repressive Wirkung auf die Zielgene des Spleißfaktors PTB ausübt.

Based on three primary sequence RNA recognition motifs (RRMs), Raver1 was defined to be a member of the hnRNP-family, although Raver1 does not seem to directly interact with RNA. Certainly, Raver1 may be involved in RNA processing by interacting with the polypyrimidine tract-binding protein (PTB) splice factor. Previous studies suggest a role of Raver1 as co-repressor of PTB by increasing the repressive function of PTB on alternative incorporated exons. In the present dissertation, biochemical analyses demonstrate for the first time that the RRMs of Raver1 are principally capable to interact with RNA molecules. Hence, it still needs to be clarified why the Raver1 full length protein does not show any interaction with RNA. Rather, the Raver1-RNA interaction occurs indirectly over PTB-RRM2 binding in vitro by forming trimary complexes consisting of Raver1, PTB and RNA molecules. For direct Raver1-PTB binding, a single interaction motif with a SLLGxxP consensus motif is essential. Thus, recruitment of Raver1 in perinucleolar compartments (PNCs) depends upon PTB protein interaction, as demonstrated by a Raver1 variant with a mutated PTB interaction motif. Comparative splicing analyses of different PTB-target genes in Raver1-deficient and wildtype mice showed for the first time that the lack of Raver1 influences PTB-mediated splicing processes in vivo. Investigations of six PTB-targets via quantitative “real-time” PCR revealed changing ratios in alternative transcripts of α-Tropomyosin, c-src and FGF-receptor2. Continuative splicing analyses on human cell lines HeLa and HEK confirmed these results. In summary, the data implicate an involvement of Raver1 in alternative splicing. However, Raver1 does not consistently modulate the alternative splicing of every studied target mRNA by its previously supposed co-repressive function on PTB-mediated splicing. Hence, the data of this work indicate that Raver1 also participates in alternative mechanisms of mRNA-processing.

Zitieren

Zitierform:

Swiniarski, Sascha: Der Einfluss von Raver1 auf „polypyrimidine tract-binding protein“- vermittelte Spleißprozesse. 2009.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export