Two-Color Two-Photon Microscopy

Quentmeier, Stefan

Die Arbeit behandelt die Entwicklung und erstmalige Realisierung eines Zwei-Farben Zwei-Photonen Mikroskops (2c2pLSM). Ziel dieser Technik ist es die Aufnahme mikroskopischer Bilder von UV-Fluoreszenz lebender Zellen zu ermöglichen. Dabei wird Fluoreszenz mit Hilfe einer Zwei-Farben Zwei-Photonen Absorption angeregt. Für die Fluoreszenzanregung werden die Fundamentale und die ersten Harmonisch Angeregte eines Ti:Sa-Femtosekundenlasers benutzt. Die gleichzeitige Absorption eines 800 nm Photons und eines 400 nm Photons ist dabei energetisch äquivalent zu einer Ein-Photonen-Absorption eines 266 nm Photons. Durch diese Technik wird die effektive Anregungswellenlänge die mit einem Ti:Sa-Laser erreicht werden kann in den UV-Bereich erweitert. Zusätzlich zu den bekannten Vorteilen eines Multiphotonenmikroskops wie intrinsische 3D Auflösung, reduzierter Photozerstörung und hoher Eindringtiefe ermöglicht 2c2pLSM die Verwendung herkömmlicher Mikroskopobjektive mit hoher numerischer Apertur für UV-Imaging. Die oben genannte effektive Anregungswellenlänge von 266 nm deckt sich dabei sehr gut mit dem Anregungsspektrum von Tryptophan. Damit stellt 2c2pLSM ein hervorragendes Handwerkszeug für die bildgebende Untersuchung von intrinscher Proteinfluoreszenz da, deren Ursache hauptsächlich Tryptophanfluoreszenz ist. Dadurch kann eine natürlich vorkommende Fluoreszenzlebensdauersonde benutzt werden um Proteinreaktionen und Proteinkonformationsänderungen zu beobachten. Diese Arbeit behandelt fundamentale Experimente mit Ziel auf die Entwicklung eines 2c2pLSM und erste Anwendungen dieser Mikroskopietechnik auf lebende MIN-6 Zellen gezeigt. Desweiteren werden weitere Beispiele für die Bedeutsamkeit dieser Technik vorgestellt, wie labelfreie Beobachtung der Bindung von Biotin an Avidin sowie die labelfreie Beobachtung der enzymatischen Abbaureaktion von BSA durch Elastase und Subtilisin.

The work presented deals with the development and first realization of a Two-Color Two-Photon Laser-Scanning Microscope (2c2pLSM). The final goal achieved with this technique are UV fluorescence images of cells. Fluorescence is excited by two-color two-photon absorption using the fundamental and the second harmonic of a Ti:Sa femtosecond laser. Simultaneous absorption of an 800 nm photon and a 400 nm photon corresponds energetically to an one-photon absorption at 266 nm. This technique for Laser-Scanning Microscopy extends the excitation wavelength range of a Ti:Sa powered fluorescence microscope to the UV. In addition to the known advantages of multi-photon microscopy like intrinsic 3D resolution, reduced photo damage and high penetration depth 2c2pLSM offers the possibility of using standard high numeric aperture objectives for UV fluorescence imaging. The effective excitation wavelength of 266 nm corresponds especially well to the excitation spectrum of tryptophan. Hence, it is an ideal tool for label free fluorescence studies and imaging of intrinsic protein fluorescence which originates mainly from tryptophan. Thus a very sensitive natural lifetime probe can be used for monitoring protein reactions or changes in conformation. In this work deals with fundamental experiments towards the realization of a 2c2pLSM as well as first measurements of living MIN-6 cells are presented. Other examples presented for the significance of this method are the monitoring of the binding of biotin to avidin and the monitoring the enzymatic digestion of BSA by elastine and subtilisine.

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Quentmeier, Stefan: Two-Color Two-Photon Microscopy. 2008.

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