Rekombinante Antikörper für "Lab-on-chip"

Al-Halabi, Laila

Das C-reaktive Protein (CRP) ist ein wichtiger Marker für bakterielle Entzündungen und wird in der Blutserumdiagnostik zeit- und kostenaufwändig in Zentrallaboratorien bestimmt. Gleichzeitig besteht aber auch der Bedarf nach einem point-of-care Mikroanalysesystem für die schnelle CRP-Diagnostik unmittelbar am Patienten, beispielsweise während einer Operation, am Krankenhausbett oder auch zu Hause bei ambulanter Behandlung. Bisher entwickelte CRP-Diagnostiksysteme basieren auf CRP-spezifischen Antikörpern aus Hybridomzellen oder Immunbibliotheken. Dabei fehlen Untersuchungen zur Antikörperstabilität, ein entscheidender Parameter für die spätere Lagerung und Regenerierung des fertigen klinischen Analysesystems. Die in dieser Arbeit aus den semisynthetischen Antikörpergen-Bibliotheken Tomlinson I und J isolierten CRP-spezifischen single chain Fv (scFv)-Antikörperfragmente sind für den Einsatz in mikrofluidische Analysesysteme geeignet. Sie wurden hinsichtlich Affinität und Stabilität sowie ihrer Antigenbindestelle (Epitop) charakterisiert und können aufgrund ihrer hohen Stabilität ohne signifikanten Funktionalitätsverlust für mehr als 2 Wochen bei 37 °C gelagert werden, besitzen eine hohe Affinität im nanomolaren Bereich (1,1 - 2,7 x 10-8 M) und eignen sich für den qualitativen Nachweis von CRP mittels eines Fließsystems. Die hier isolierten und charakterisierten Antikörperfragmente erkennen spezifisch natives CRP als auch partiell denaturiertes Neo-CRP. Die Implementierung der CRP-spezifischen Antikörper in den Quarz-Mikrosensor wurde hinsichtlich Antikörperformat, chemischer Kopplungsmethode und Absättigungsreagenz in goldbeschichteten Mikrotiterplatten optimiert, diese Parameter wurden bereits auf dem mikrofluidischen Quarzsensor umgesetzt. Dabei erfolgten Messungen von reinen CRP-Lösungen auf dem Quarzmikrosensor, nach sechs Regenerationsschritten kam es weiterhin zu einer gleichbleibend sensitiven und spezifischen Detektion von CRP. Mit diesen Messungen wurde erstmals der Einsatz CRP-spezifischer scFv-Antikörperfragmente aus einer semisynthetischen Antikörpergen-Bibliothek in einem Immunosensor, das wiederholte Messungen von CRP in einem konstanten Fluß ermöglicht, gezeigt. Damit gelang die erfolgreiche Isolation und zusätzliche Charakterisierung CRP-spezifischer Antikörperfragmente für die Entwicklung eines quarzbasierten Immunosensors, mit dem sich Blutserumanalysen direkt am Patienten mit einem geringem Zeitaufwand durchführen lassen können.

C-reactive protein (CRP) is an important marker for bacterial infections. CRP determination is conducted in centralised laboratories, requiring much time at high costs. Hence, there is a great demand for a "point of care" micro total analysis system (µTAS) for fast and immediate CRP diagnosis, e. g. during surgeries or as bedside tests. Known CRP diagnostic systems are based on antibodies derived from hybridoma cell lines or antibody gene immunolibraries. Until now no examinations concerning antibody stability - a crucial issue for handling and storage of the prefabricated diagnostic system - have been performed. CRP-specific single chain Fv (scFv) were isolated from the semisynthetic antibody gene libraries Tomlinson I and J and can be applied in microfluidic analysis systems. They are characterised regarding affinity, stability and antigen binding site and can be stored for more than 2 weeks at 37 °C without loss of functionality due to their high stability. Additionally they are highly affine, with kD values within the nanomolar range (1,1 - 2,7 x 10-8 M) and are therefore suitable for qualitative determination of CRP via a flow system. The here isolated and characterised CRP-specific antibody fragments bind both native CRP and partial denatured Neo-CRP. Implementation of CRP-specific antibodies into a quartz microsensor system are optimised in a gold coated mitcrotitre plate model regarding to antibody format, bonding technology and blocking solution, furthermore the obtained parameters were transferred to the microfluidic quartz micro sensor. A minimum of 6 repetitive steps of CRP measurement followed by sensor regeneration were possible without loss of sensitivity or specificity. Here, the application of CRP-specific scFv antibody fragments derived from a semisynthetic antibody gene library in an immunosensor was shown for repeatable measurements of CRP in a constant flow. With these measurements the isolation and additional characterisation of CRP-specific antibody fragments for the development of a quartz crystal immunosensor suceeded for fast blood serum analysis as a "point of care" application.

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Al-Halabi, Laila: Rekombinante Antikörper für "Lab-on-chip". 2008.

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