Funktionelle Analysen von epithelialen Transmembranproteinen bei Drosophila melanogaster

Harder, Ben

Das für die barrier function von Drosophila-Epithelien essenzielle Transmembranprotein Megatrachea (Mega) konnte in der Vergangenheit mit herkömmlichen Methoden nicht detailliert untersucht werden. Es wurde daher die tobacco-etch-virus- (TEV-) Protease in Drosophila als Methode etabliert, um Proteine in vivo posttranslational an artifiziellen TEV-Protease-Zielsequenzen zu spalten. TEV-Protease gestützte Studien des Transmembranproteins Mega zeigten, dass sich TEV-Protease-vermittelt seine Funktion stören lässt und dadurch tracheale mega-Phänokopien erzeugt werden. So wurde eine funktionelle Trennung des Mega-C-Terminus von der Mega- Gesamtfunktion möglich. Mega ist als Claudin für die Ausbildung der transepithelialen Barriere, der septate junctions und an einer normalen trachealen Morphogenese beteiligt. Es zeigte sich durch TEV-Protease-gestützte Analysen, dass der Mega-C-Terminus essenziell für die Exozytose wichtiger Deacetylasen ist. Durch das Abspalten des Mega-C-Terminus kam es zur Störung dieser Exozytose und zu trachealen mega-Phänokopien, die morphologisch mega-Funktionsverlustmutanten sehr ähnlich waren. Diese Phänokopien äußerten sich im Gegensatz zu mega-Mutanten jedoch nicht im Verlust der transepithelialen Barriere oder der Zerstörung der septate junctions. Somit konnte ich in Drosophila eine neue Methode etablieren, die gewebe- und zeitabhèngig in vivo Studien von Proteinen und Proteinkomplexen ermöglicht. In Drosophila ist über die genaue Funktion von Synapsen wenig bekannt. Ich konnte Hot Dog als erste, putative Calcium-Kanal Gamma Untereinheit in Drosophila identifizieren. Meine Untersuchungen zeigen, dass das Hot Dog-Protein die Reizweiterleitung von Motorneuronen in Drosophila moduliert. Durch die Lokalisation des Hot Dog-Proteins konnten darüber hinaus neuartige, abgegrenzte Subzonen an der neuromuskulären Verbindung von Drosophila entdeckt werden.

The transmembrane protein Megatrachea (Mega) is essential for the barrier function of epithelia in Drosophila and could not be analysed in detail by using conventional methods. Therefore, the tobacco-etch-virus- (TEV-) protease was established as a tool in Drosophila to cleave proteins posttranslationally at artificial TEV-protease-target sequences. TEV-protease based studies of the transmembrane protein Mega revealed, sequence specific Mega-cleavage. Mega represents a claudin which is involved in the development of the transepithelial barrier, the septate junctions and a normal tracheal morphology. TEV-protease mediated Mega cleavage in vivo revealed, that the Mega-C-terminus is essential for the exocytosis of particular chitin-deacetylases and evokes elongated tracheal branches as found in mega mutant embryos. In contrast, the lack of the Mega-C-Terminus does not affect wildtype-like septate junction formation and the transepithelial barrier function. Thus, I established a novel method in Drosophila which may provide a powerful tool to gain insights into the in vivo network formation in a multicellular natural environment. I also identified the gene product of hot dog as the first putative calcium-channel gamma subunit in Drosophila. My studies have shown, that the Hot Dog-protein modulates the activity of motorneurons. The Hot Dog-protein localizes to new, separated subzones at the neuromuscular junction in Drosophila.

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Harder, Ben: Funktionelle Analysen von epithelialen Transmembranproteinen bei Drosophila melanogaster. 2009.

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