Analyse der funktionellen Diversität der Profilin-Isoformen 1 und 2a

Murk, Kai Thomas

Profiline sind kleine Aktin-bindende Proteine, die den Nukleotidaustausch der Aktin-Monomere beschleunigen und diese an die Plus-Enden der Aktin-Filamente befördern. Da diese Funktionen für die Aktin-Dynamik essentiell sind, ist die Existenz gewebsspezifischer Profilin-Isoformen weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich das in Mammalia ubiquitäre Profilin 1 (PFN1) und das ZNS-spezifische Profilin 2a (PFN2a) redundant zueinander verhalten oder ob sie unterschiedliche Funktionen besitzen. Trotz ähnlicher biochemischer Eigenschaften lokalisieren PFN1 und PFN2a unterschiedlich in Neuronen: Während PFN1 überwiegend homogen in den Neuriten verteilt ist, akkumuliert PFN2a in synaptischen Strukturen. Zudem wurde in dieser Arbeit ein RNAi-System entwickelt, mit dem endogene Proteine gegen exogene Varianten substituiert werden können. Mit diesem „Knock down & Knock in“-System wurde der Einfluss von PFN2a auf organotypisch kultivierte CA1-Neurone untersucht. Der Verlust von PFN2a verringert die Anzahl von dendritischen Verzweigungen sowie von „dendritic spines“. Die Substitution des endogenen PFN2a mit einer Profilin-Mutante mit reduzierter Aktin-Bindung hat gezeigt, dass die dendritische Morphologie auf der Interaktion von PFN2a mit Aktin beruht. Hingegen bewirkt die Expression einer Poly-Prolin-Bindungsmutante von PFN2a eine normale dendritische Komplexität und eine signifikant erhöhte Anzahl der „dendritic spines”. Sequenzvergleiche ergaben, dass PFN2a höher konserviert ist als PFN1. Darüber hinaus belegten Expressionsanalysen von PFN1 und PFN2a, dass PFN2a im Huhn ubiquitär exprimiert wird. RNAi-Experimente haben zudem gezeigt, dass in Hühnerfibroblasten vornehmlich PFN2a anstelle von PFN1 die Zelladhäsion und Zellmotilität moduliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass PFN2a neuro-spezifische Funktionen ausübt. Andererseits weisen die Befunde an Hühnerzellen daraufhin, dass PFN2a prinzipiell auch als Aktin-Regulator fungieren kann.

Profilins are small actin-binding proteins that accelerate the nucleotide-exchange of G-actin and deliver it to plus-ends of actin-filaments. According to the substantial contribution of profilin to actin dynamics, the functions of tissue-specific profilin-isoforms are poorly understood. Here, the functional diversity of the in Mammals ubiquitously expressed profilin 1 (PFN1) and the CNS-restricted profilin 2a (PFN2a) were studied. Although possessing similar biochemical properties, PFN1 and PFN2a exhibit differential localizations in neurons. Whereas PFN1 is homogenously distributed, PFN2a accumulates at synaptic structures. Furthermore, a RNAi-system were also developed that enables the simultaneous depletion of endogenous target proteins and the expression of exogenous variants. This so-called ôKnock down & knock inö-system were utilized to study the functions of PFN2a in organotypic-cultivated CA1-neurons. RNAi-mediated gene silencing of PFN2a leads to loss of dendritic arborizations and reduces significantly the number of dendritic spines. The substitution of endogenous PFN2a against a mutant deficient in actin binding demonstrates the modulation of dendritic morphology by the direct interaction of PFN2a and G-actin. However, the expression of PFN2a with disrupted poly-proline binding site restores dendritic complexity and increases significantly the density of dendritic spines in CA1-neurons. Phylogenetic analysis revealed that PFN2a is better conserved among vertebrates than PFN1. However, analysis of expression pattern showed that PFN2a is ubiquitously expressed in chicken tissues. Additionally, knock down experiments in chicken fibroblasts revealed the predominant involvement of PFN2a in processes of actin-based motility. In summary, the results of this work demonstrate specific functions of PFN2a in the mammalian CNS, whereas experiments in chicken show that PFN2a can principally serve as regulator of actin dynamics in non-neuronal cells.

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Murk, Kai Thomas: Analyse der funktionellen Diversität der Profilin-Isoformen 1 und 2a. 2008.

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