Production of L-methionine with Corynebacterium glutamicum

Reershemius, Hajo Kampe

Ziel dieses Projektes war das Screening nach mikrobiellen Überproduzenten der Aminosäure L-Methionin durch zufallsbasierte Mutagenese (UV-Bestrahlung und nachfolgende Selektion). Daraufhin sollte die Produktion im Schüttelkolben- und Bioreaktormaßstab durch Variation der biochemischen (Nährstoffkonzentrationen, pH) und generellen Kultivierungsparameter (Temperatur, Schüttel- und Drehzahlraten, im Bioreaktor: Sauerstoffpartialdruck und Zufütterungsstrategien) optimiert werden. Zunächst war die Entwicklung eines schnellen und effizienten Screenings- und Selektionssystems für mikrobielle Überproduzenten von L-Methionin das Hauptziel des Projektes. Dafür wurde der Stamm Corynebacterium glutamicum DSM20300 benutzt. Als grosses Problem stellte sich die Etablierung eines effizienten Selektionssystem zum Aussortieren potentieller Kandidaten für die Aminosäureanalyse heraus. Ein weiterer Punkt war die Suche nach Mikroorganismen, die bereits die Fähigkeit zur Produktion von Methionin besitzen. Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC21608 ist kommerziell an einer amerikanischen Stammsammlung erhältlich. In verschiedenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass dieser Stamm die Fähigkeit zur L-Alaninproduktion in Mengen um die 200 mg/l besitzt. L-Methionin wurde von diesem Stamm nicht überproduziert. Der Stamm Corynebacterium glutamicum KY10574 wurde von der Firma Kyowa Hakko Kogyo, Japan, Tokio zur Verfügung gestellt. Hier konnte eine L-Methioninproduktion beobachtet werden. In den ersten Untersuchungen konnten L-Methionin Konzentrationen zwischen 100 – 150 mg/l im Überstand gemessen werden, in weiteren Experimenten im Schüttelkolben- und Bioreaktormaßstab wurden Konzentrationen zwischen 1,4 und 1,5 g/l erzielt. Wichtige Parameter für diese Optimierung waren die Herstellung eines adäquaten Minimalmediums, die Sauerstoffversorgung und die Zufütterungsstrategie (Glucose) im Bioreaktor.

Targets of this project were the screening for microbial overproducers of L-methionine by random mutation (UV-radiation plus following selection) and optimization of the production in shake flask and bioreactor scale by varying of biochemical (nutrient concentration, pH) and general cultivation parameters (temperature, stirring speed, in bioreactor: oxygen partial pressure and fed batch). In this context one major focus of the research was the development of a fast screening and selection system for microbial overproducers of L-methionine. For the necessary experiments the strain Corynebacterium glutamicum DSM20300 was used. A big problem was the selection system after radiation with ultraviolet light (UV) to sort out potential candidates for the analysis. A second challenge was the searching for microorganisms already containing the property to overproduce L-methionine. One strain, Corynebacterium glutamicum ATCC21608, is commercially available from a public collection of microorganisms in the USA. It could be shown in several experiments, that this bacterium is able to produce L-alanine in small amounts (200 mg/l) but L-methionine could not be produced in significant quantities. The strain Corynebacterium glutamicum KY10574 has been obtained from the company Kyowa Hakko Kogyo, Japan, a well-known producer of amino acids with microorganisms. A successful accumulation of L-methionine was observed. In first experiments the concentration of L-methionine in the supernatant of the cultivations was about 100 – 150 mg/l, in further experiments in the shake flask (several scales) and the bioreactor (3 – 3.5 litres) L-methionine concentrations of 1.4 – 1.5 g/l could be achieved. For both bioreactor and shake flask scale significant parameters for this optimization were the creation of an adequate minimal medium and the oxygen supply in combination with the stirring speed.

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Reershemius, Hajo Kampe: Production of L-methionine with Corynebacterium glutamicum. 2008.

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