Antikörpervarianten mit verbesserter Affinität

Thie, Holger

Therapeutische Antikörper gewinnen bei der Behandlung verschiedener Krebsarten mehr und mehr an Bedeutung. Ein Zielmolekül für eine antikörperbasierte Therapie ist Mucin 1 (MUC1). In vielen Adenokarzinomen wird MUC1 basolateral überexprimiert und weist veränderte O-Glykosylierungen auf. Die aberranten Glykosylierungen machen neue Peptidepitope zugänglich und stellen selbst Neoantigene dar. Das humane single chain Fv (scFv) Antikörperfragment IIB6 wurde in einer vorhergehenden Arbeit (Toleikis, 2004) mittels Phagen-Display gegen tumorassoziiertes MUC1 selektiert. Es besitzt jedoch nur eine niedrige Affinität zu MUC1 (KD = 2,3 x 10-7 M) und bindet an ein Peptid-Epitop in der extrazellulären VNTR-Region. Durch Affinitätsreifung von IIB6 scFv wurden hochaffine Antikörperfragmente gegen MUC1 generiert und anschließend charakterisiert. Es wurden zufällige Mutationen mittels sequenzieller Error-prone-PCR in das IIB6 scFv Genfragment eingebracht und Antikörpergenbibliotheken generiert. Durch stringente Selektionsmethoden wurden Antikörperklone mit verbesserter Bindung an MUC1 isoliert. Für den scFv-Klon HT186-D11 wurde eine deutlich erhöhte Affinität zu MUC1 gemessen (KD = 5,7 x 10-10 M). Alle untersuchten Klone banden an das gleiche Peptidepitop (RPAP) in der VNTR-Region von MUC1. Die affinitätsgereiften Klone besitzen eine verringerte Aggregationsneigung und gleichzeitig eine deutlich verbesserte Langzeitstabilität verglichen mit IIB6 scFv. Mittels durchflusszytometrischer Analysen wurde eine spezifische Bindung an MUC1+ Tumorzelllinien nachgewiesen. Eine bioinformatische Analyse zeigte gehäufte Aminosäureaustausche im CDR2-Bereich von VL. Die in dieser Arbeit generierten affinitätsgereiften MUC1-spezifischen scFv-Fragmente zeigen ein großes Potential für die Diagnose und Behandlung von MUC1+ Adenokarzinomen. In weiteren Experimenten wurde die Steigerung der apparenten Affinität durch Multimerisierung der Antikörperfragmente und Ausnutzung des Aviditätseffekts untersucht.

Therapeutic antibodies are gaining in importance in the treatment of different cancer diseases. One target molecule for an antibody-based therapy is Mucin 1 (MUC1). In many adenocarcinomas MUC1 is basolateral overexpressed and exhibits altered O-glycosylations. These aberrant glycosylations result in new epitopes based on the different glycosylations or the peptide backbone of MUC1. The human single chain Fv (scFv) antibody fragment IIB6 was isolated against tumor-associated MUC1 by phage display (Toleikis, 2004). This antibody fragment binds a peptide epitope within the extracellular VNTR-region of MUC1 with low affinity (KD = 2,3 x 10-7 M). High affinity binders against MUC1 were generated by an affinity maturation of IIB6 scFv. Random point-mutations were introduced into the IIB6 scFv gene by error-prone-PCR and subsequently antibody gene libraries were constructed. These libraries were screened for high affinity binders by different stringent panning strategies. For HT186-D11 a drastically increased affinity (KD = 5,7 x 10-10 M) to MUC1 was observed. All characterized clones bound to the same peptide-epitope (RPAP) in the VNTR-region of MUC1. The affinity matured clones showed a significant lower aggregation-tendency and a better long-term stability compared with IIB6. Binding to tumor-cell associated MUC1 was validated by flow cytometry experiments. Bioinformatical analysis of the amino acid sequence showed a cluster of amino acid substitutions within the CDR2 of VL. The affinity matured MUC1-specific antibody fragments show a high potential for diagnostic and antibody-based therapies for the treatment of MUC1+ adenocarcinomas. In further experiments gaining apparent affinities by antibody-multimerization utilizing the avidity effect were investigated.

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Thie, Holger: Antikörpervarianten mit verbesserter Affinität. 2008.

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