Cellular, biochemical and phylogenomic analyses of the mouse Jumonji domain containing 6 protein provide new evidence for functions as a 2-oxoglutarate dependent dioxygenase

Hahn, Phillip Holgar Heinrich

Das “jumonji domain containing 6”-Protein (Jmjd6) ist an der embryonalen Gewebedifferenzierung und der Zytokinausschüttung aktivierter Makrophagen beteiligt. Wegen der Bedeutung von jumonji C (JmjC) Domäne-Proteinen bei der oxidativen DNA und RNA Reparatur, der Protein Hydroxylierung und der Histon Lysin-Demethylierung wurde der Lokus, die Evolution und die Proteinfunktion von Jmjd6 analysiert. In Spezies aller heutigen Phyla wurden 61 Maus-Jmjd6-homologe Sequenzen identifiziert. Dies führte zu der Identifizierung und Charakterisierung einer bidirektionalen Transkriptionseinheit aus Jmjd6 und dem benachbarten 1110005A03Rik Lokus, eines neuen Jmjd6 Exons sowie zweier neuer Splice-Varianten in vivo. Ein berechnetes und kreuz-validiertes Strukturmodell von Jmjd6 identifiziert eine doppelsträndige ß-Helix (DSBH)-Faltung, eine 2-His-1-Carboxylat-Triade und eine 2-Oxoglutarat-Koordinierungsstelle als wahrscheinliche Strukturmotive. Durch mAB328, einem neu generierten anti-Jmjd6 Antikörper, konnte gezeigt werden, dass endogenes Jmjd6 ein nukleäres und nukleoläres, zellzyklusabhängiges Protein ist, dass keine Kolokalisation mit heterochromatischer DNA zeigt. Western Blot-Analysen zeigten zudem, dass vollständige Jmjd6-Proteine Multimere formen und sich N-terminal eine Multimersierungsdomäne befindet. Eine Funktion als Demethylase von H3K4, H3K9, H3K27, H3K36 und H4K20 Histon Methylierungsstatien konnte durch den Vergleich von Wildtyp und Jmjd6 -/- Zellen sowie durch Überexpression von Jmjd6-Reporterkonstrukten ausgeschlossen werden. Nuklease-basierte Tests zeigten zudem, dass Jmjd6 wahrscheinlich mit einer ribonuleären Matrix assoziiert. Zusammengefasst wurden zusätzliche Beweise für eine Funktion als nonheme-Fe(II)-2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase und neue Einblicke in die Evolution von Jmjd6 und JmjC-Domänen erbracht. Die Ergebnisse legen nahe, dass die enzymatische Funktion von Jmjd6 gegen RNA oder RNA-assoziierte Proteine und nicht gegen Histon Lysin-Reste gerichtet ist.

The “jumonji domain containing 6” protein (Jmjd6) is involved in embryogenetic tissue differentiation and cytokine release of activated macrophages. Given the importance of jumonji C (JmjC) domain-containing proteins in oxidative DNA and RNA repair, protein hydroxylation, and histone lysine demethylation, an analysis of the Jmjd6 locus, evolution, and protein function was carried out. Sequences homologous to the mouse Jmjd6 protein were identified in 61 species from all major living phyla. This lead to the identification and characterisation of a bi-directional transcriptional unit comprising Jmjd6 and the neighbouring 1110005A03Rik locus, verification of a novel Jmjd6 exon and two new splice variants in vivo. A calculated and cross-validated structural model of the Jmjd6 protein identified a conserved double stranded ß-helix (DSBH) fold, an 2-His-1-carboxylate facial triad, and a 2-oxoglutarate co-ordination site as structural motifs. Using mAB328, a newly generated monoclonal anti-Jmjd6 antibody, it was shown that endogenous Jmjd6 is a nuclear and nucleolar, cell cycle dependent protein with no co-localisation to heterochromatic DNA. Western blot analyses showed that Jmjd6 forms homo-multimers, that homo-multimerization requires the full-length protein and identified an N-terminal protein multimerization domain. An analysis of H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, and H4K20 histone methylation states in wildtype and Jmjd6 -/- cells and overexpression of Jmjd6-reporter constructs excluded a function of Jmjd6 in the demethylation of these residues. Finally, nuclease assays showed a likely association of Jmjd6 to a ribonucleic matrix. In conclusion, additional evidence that Jmjd6 functions most likely as a nonheme-Fe(II)-2-oxoglutarate-dependent dioxygenase and novel insights into the evolution of Jmjd6 and JmjC domain-containing proteins are provided. The results suggest that enzymatic targets of Jmjd6 might be RNA or RNA-associated proteins and not histone lysine residues.

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Hahn, Phillip Holgar Heinrich: Cellular, biochemical and phylogenomic analyses of the mouse Jumonji domain containing 6 protein provide new evidence for functions as a 2-oxoglutarate dependent dioxygenase. 2007.

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