Multifunktionale DNA Kassetten zur konditionalen Mutagenese in der Maus

Nawrath, Karina Maria

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden bifunktionale Cre Expressionskonstrukte erzeugt. Diverse Konstruktvarianten exprimieren in ihrer ursprünglichen Form eine Hormon abhängige Fusionsrekombinase, die in vivo durch FLP vermittelte Rekombination auf eine konstitutiv aktive Rekombinaseform umgeschaltet werden kann. Ein weiteres Konstrukt dient in seiner ursprünglichen Form der Expression eines konstitutiv aktiven Fusionsproteins und erlaubt in vivo durch FLP vermittelte Rekombination das Umschalten auf die Expression einer Liganden induzierbaren Fusionsrekombinase. Mit diesem bifunktionalen Konstrukt konnte ein gutes Signal-zu-Rausch Verhältnis erzielt werden, so dass es zur Herstellung einer transgenen Maus geeignet ist, die eine konstitutiv aktive Rekombinase unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors exprimiert. Durch Verpaarung mit einer FLP Rekombinase exprimierenden Maus können Nachkommen erhalten werden, die dann eine Liganden induzierbare Fusionsrekombinase gewebespezifisch exprimieren. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Herstellung von DNA Kassetten, die zur konditionalen Inaktivierung von Genen oder zur Reaktivierung zuvor inaktivierter Gene in eukaryotischen Zellen oder in der Maus eingesetzt werden können. Die Funktion der generierten induzierbaren NMD Kassetten beruht auf dem Einsatz von Exons, in die Stopcodons in alle drei Leseraster eingeführt wurden. Wird eine entsprechende Kassette in Transkriptionsrichtung in ein beliebiges Zielgen inseriert, so wird eines der drei Stopcodons als prämatures Terminationscodon erkannt, wodurch der nonsense mediated mRNA decay Prozess ausgelöst wird, der zur Degradierung der mRNA und damit zur Inaktivierung der Genaktivität führt. Eine konditionale Geninaktivierung wird erzielt, indem die Kassette mit Rekombinase Erkennungssequenzen flankiert wird, die eine Inversion ermöglichen. Dabei kann die Kassette von dem kodogenen in den nicht kodierenden Strang invertiert werden, wodurch die Genaktivität wiederhergestellt wird.

The first part of the thesis describes the generation of bi-functional cre expression constructs. Diverse construct variants express in their original form a hormone-dependant fusion recombinase, which can be switched in vivo by FLP mediated recombination to a constitutively active recombinase. The original form of a different construct is suitable for the expression of a constitutively active fusion protein thus allowing the expression of a ligand-inducible recombinase after FLP mediated recombination in vivo. This bi-functional construct showed a good signal-to-noise ratio and hence might be used for the generation of a transgenic mouse expressing a constitutively active recombinase under a tissue specific promoter. By mating such a mouse line with a different one expressing FLP recombinase offspring expressing a ligand-inducible fusion recombinase in a tissue specific fashion can be obtained. In the second part of the thesis the generation of DNA cassettes is described for conditional inactivation of genes respectively for reactivation of previously inactivated genes in eukaryotic cells or in the mouse. The function of the developed inducible NMD cassettes is achieved by the use of exons with inserted stop codons in all three open reading frames. After introducing this cassette in any desired target gene, one of the stop codons is recognized as a premature termination codon and nonsense mediated mRNA decay pathway is activated leading to mRNA degradation and loss of gene activity. Conditional gene inactivation is achieved by flanking the cassette with recombinase target sequences, which allow its inversion. Thereby the inducible NMD cassette can be inverted from coding to noncoding strand reconstituting gene activity.

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Nawrath, Karina Maria: Multifunktionale DNA Kassetten zur konditionalen Mutagenese in der Maus. 2008.

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